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植物甾醇酯分析方法 　　摘要：建立了植物甾醇酯的分析方法，包括植物甾醇酯中的总甾醇、游离甾醇和甾醇酯含量的分析。样品通过与KOH皂化，提取出植物甾醇，进行气相分析。采用内标法测定总甾醇和游离甾醇含量，通过计算得到甾醇酯含量。结果表明，此方法经济简单，分离度和重复性较好，准确度高。 　　关键词：植物甾醇酯 总甾醇 内标法 　　中图分类号：TQ645.9 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）18-0016-03 　　植物甾醇是从植物油工业副产物中得到的一种具有多种生理活性的天然活性物质，主要功效在于可降低人体低密度脂蛋白水平[1]并有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化和抗炎等功能[2]。但是由于植物甾醇的疏水性和弱油溶性导致了其在人体内的溶解性和生物利用性较差[3]。研究发现，不饱和脂肪酸和植物甾醇结合形成的不饱和脂肪酸植物甾醇酯可以提高植物甾醇的油溶性，并且安全性更高[4]，应用范围更广。由于植物甾醇酯的应用越来越广泛，传统的一些甾醇分析方法并不能够满足应用的需求，因此建立方便快捷的植物甾醇酯分析方法日趋重要。传统对甾醇的分析方法主要是毛地黄皂甙法、酶法、薄层色谱法、高效液相色谱法[6]、气相色谱[7]等方法，其中气相色谱分析法对各甾醇组分分离度较好，但需要经过衍生化处理导致步骤比较繁琐，另外，植物甾醇酯的沸点很高需要采用高温色谱柱来分析[8]，这对设备的要求很高且色谱柱损耗大进一步提高了分析成本。鉴于此，本文中采用的方法的优势在于植物甾醇酯样品经处理后，不需衍生化，可直接用气相色谱分析植物甾醇酯中总甾醇含量和游离甾醇含量并且对设备要求低，重复性好，操作简单，准确度高。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　无水乙醇（AR）、KOH（AR）、硫酸（AR）、丙酸酐（AR）、吡啶（AR）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；植物甾醇（95）购于江苏春之谷生物制品有限公司；植物甾醇酯（95）购于cognis生物制品有限公司；胆固醇（95）购于湖南湘原植物生化有限公司；N，0一双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（简称BSTFA）（98）购于上海益民化工有限公司。 　　1.2 主要仪器 　　Agilent 6820气相色谱仪，Agilent Technol-ogies Inc； 　　氢火焰离子化检测器，Agilent Technologies Inc； 　　DB-5高温色谱柱（0.32*30），Agilent Technologies Inc； 　　PL203电子精密天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司； 　　水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。 　　1.3 气相色谱分析条件 　　检测器：FID，温度300℃； 　　气体流量：氢气30mL/min，空气300mL/min，载气：氮气，25mL/min； 　　进样温度300℃； 　　分流进样，分流比为50：1； 　　柱温（程升）：起始温度180℃，保持1min，以5℃/min升温至260℃，保持20min； 　　进样量0.6 L，柱压10psi。 　　1.4 样品的处理 　　1.4.1 植物甾醇95的标准曲线绘制 　　称取0.05 g植物甾醇95配成25mL浓度为2mg/mL的标准品溶液；称取0.05g内标物配成25mL浓度为2 mg/mL的内标物溶液；分别取标准品1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、4mL加入1mL内标物溶液后稀释到5mL，进样量为0.6μL。 　　1.4.2 总植物甾醇含量的测定 　　在250ml锥形瓶中加入0.3500g植物甾醇酯样品、 0.06g胆固醇内标物、5g氢氧化钾和50ml无水乙醇，在79℃下回流搅拌30分钟后向反应瓶中加入25ml水并用25ml正己烷萃取静置分层。最后，取2mL的上层液稀释4倍后进行气相检测（进样量为0.6μL），测定样品中总甾醇含量。 　　1.4.3 游离植物甾醇含量的测定 　　称取样品0.5000g，加入0.01g胆固醇内标物以及10mL正己烷，稀释3倍后进行气相检测，测定样品中游离甾醇的含量。 　　2 结果与讨论 　　2.1 气相色谱分析条件的选择 　　2.1.1 色谱柱的选择 　　植物甾醇属于高沸点、热稳定性好的物质，必须选择能耐高温、有良好惰性的柱子。本文采用具有以上特性的DB-5色谱柱（30m×0.32mm×0.10μm）。 　　2.1.2 程序的选择 　　程序升温速度应该适当，过快会使植物甾醇中各组份无法完全分离而过慢会使分析时间变长，峰型也较差。起始温度考查了160℃-210℃，最终确定的最适合温度为180℃，保持1min。另外，升温速率考查了3℃/min、5℃/min和10℃/min，并确定了5℃/min的最佳升温速度，在此升温