生长因子1诱骗寡核苷酸对大鼠颈总动脉球囊损伤后血小板源性生长因子BB表达影响.docVIP

生长因子1诱骗寡核苷酸对大鼠颈总动脉球囊损伤后血小板源性生长因子BB表达影响 　　[摘要] 目的 探讨针对早期生长反应因子-1（Egr-1）的诱骗性寡脱氧核苷酸（decoy ODN）对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。 方法 制备大鼠颈动脉球囊损伤模型，将96只Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯损伤组、杂码寡脱氧核苷酸（SCR）组和治疗组，每组24只。术后3、7、14、21 d处死动物，每组6只。应用HE染色、Real time RT-PCR和Western blot方法观察大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生情况、Egr-1和血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）的表达及Egr-1 decoy ODN对它们的影响。 结果 ①内皮损伤后3 d内膜增厚不明显，7 d内膜开始增厚，14、21 d时内膜明显增厚。②Egr-1 mRNA和蛋白水平于术后3 d开始升高，21 d时达到顶峰，而PDGF-BB的mRNA和蛋白水平均于3 d开始升高，14 d时达到顶峰。③转染Egr-1 decoy ODN治疗后，在各个时间点内膜增厚程度减轻，与对照组比较，Egr-1和PDGF-BB表达明显减少，差异有高度统计学意义（P 0.01）。 结论 Egr-1 decoy ODN可能是通过特异性抑制Egr-1的表达，进而抑制PDGF-BB的表达，达到减轻新生内膜厚度、从而减轻血管损伤后内膜增生的目的。 　　[关键词] 诱骗性寡脱氧核苷酸；早期生长反应因子-1；动脉损伤；内膜增生 　　[中图分类号] R543.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（b）-0018-04 　　冠心病是临床多发病症，在现代社会当中，冠心病患者也逐年增加，临床治疗冠心病的方法较多，但目前为止还没有标准的治疗方案，从冠心病患者的形成机制进行研究，分析形成冠心病的主要因素，可以在很大程度上提高患者的临床治疗效果，达到临床治疗的目的。血小板源性生长因子 （platelet derived growth factor，PDGF）是促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的重要的生长因子，尤其是血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）刺激VSMC的作用更强烈[1-2]。文献证实，抑制其活性可以很好地起到抑制RS的作用[1-2]。本次研究主要通过大鼠颈总动脉球囊损伤后的PDGF-BB分析，观察生长因子-1诱骗寡核苷酸对其影响，进而分析临床治疗的可行性，详细研究内容如下： 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　研究选用北京医科大学提供的健康雄性Wistar大白鼠96只，美国Baxter health corporation生产的2F Fogarty导管，Egr-1 decoy ODN、Egr-1杂码寡核苷酸（scrambled decoy ODN，decoy ODN SCR）、Santa Cruz公司出产的Egr-1兔抗大鼠多克隆抗体，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、武汉博士的公司出产的PDGF-BB兔抗大鼠多克隆抗体，大连宝生物公司出产的PCR引物合成，瑞士Roche公司生产的FuGENE6试剂。 　　1.2 方法 　　首先采用10%水合氯醛对Wistar大鼠进行麻醉，之后取大鼠颈部中间入路，将大鼠的左颈部动脉进行钝性分离，使用血管夹进行左颈动脉暂时性的阻断，采用2F导管插入大鼠左颈动脉，注入0.2 mL的0.9%氯化钠，最后反复抽拉大鼠的左颈动脉，制作大鼠左颈动脉内膜损伤模型[3]。 　　将96只大鼠按照随机原则分为4组，每组大鼠24只，在分组之后，标注组别，并根据组别进行不同的手术及研究。其中第一组为假手术组，采用分离左颈动脉，之后不进行球囊拉伤；第二组为损伤组，在大鼠球囊拉伤之后注入200 μL的1 mmol/L MgCl2液；第三组为SCR组，拉伤大鼠的左颈总动脉后注入200 μL含有500 μg SCR ODN、30 μL转染试剂FuGene6的1 mmol/L MgCl2液；第四组为治疗组，在大鼠左总动脉球囊拉伤之后，局部注入200 μL含有500 μg FITC标记的decoy ODN、30 μL转染试剂FuGene6的1 mmol/L MgCl2溶液。不同组别大鼠处理完成之后，分别进行观察研究，研究期间将每组24只大鼠分为4个小组，每个小组6只大鼠，进行观察研究。 　　设计合成Egr-1特异诱骗寡核苷酸和Egr-1杂码寡核苷酸Egr-1特异诱骗寡核苷酸基因序列为：上游5-TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG-3，下游3-AGCGGGGGC