玉米赤霉烯酮对原代大鼠睾丸支持细胞增殖相关基因表达以及氧化应激影响.docVIP

玉米赤霉烯酮对原代大鼠睾丸支持细胞增殖相关基因表达以及氧化应激影响 　　摘要：研究玉米赤霉烯酮（ZEA）体外对原代大鼠睾丸支持细胞（sertoli cell）增殖相关基因波形蛋白（vimentin）和细胞周期蛋白D1（CCND1）表达及对氧化应激中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力的影响。体外分离培养原代大鼠睾丸支持细胞，不同浓度的ZEA作用细胞20 h，采用MTT法检测细胞活力，荧光定量PCR检测Vimentin、CCND1基因mRNA的表达，Westblot检测其蛋白的表达，并且检测细胞培养液中SOD、GSH-PX活力。结果表明：与对照组相比，Vimentin、CCND1 mRNA表达量都随着ZEA浓度的升高而降低，但是Vimentin蛋白表达量却没有明显变化，CCND1蛋白表达量和mRNA表达量一致。SOD活性、GSH-PX活性均随着ZEA浓度的升高呈现增高趋势。结果表明，ZEA对体外培养大鼠支持细胞具有生殖毒性作用，影响Vimentin、CCND1的表达调控，导致细胞产生氧化应激效应从而使SOD与GSH-PX活性产生变化。 　　关键词：玉米赤霉烯酮；原代睾丸支持细胞；波形蛋白；周期蛋白D1；氧化应激酶 　　中图分类号：Q786 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0299-05 　　玉米赤霉烯酮（ZEA）别称F-2毒素，是由镰刀菌产生?A一种霉菌毒素，并且是一种类雌激素毒素。ZEA最初于1962年从污染了禾谷镰刀菌的发霉玉米中分离得到，1966年正式定名[1-2]。镰刀菌主要侵害玉米、小麦、燕麦、大麦等作物，产生的ZEA具有生殖发育毒性、免疫毒性，对肿瘤发生也有一定影响，对人、动物健康具有潜在危害，日益受到人们重视。ZEA在全世界范围内均有发现，甚至在人们的食物中也能检测到ZEA的存在[3]。睾丸支持细胞作为生精细胞的支架，能够分泌雄激素结合蛋白以及产生类固醇类，为生精细胞提供充足的雄性激素和必需的营养物质，同时还能保证血睾屏障和体内微循环、精子的发育和成熟，从而调节生殖系统的功能[4]。所以，支持细胞受到损伤会直接影响精原细胞、精母细胞、精子细胞失去发育和成熟的营养保证，导致各级生精细胞数量减少、结构改变、细胞核模糊、细胞器减少等[5]，从而使雄性生殖系统出现问题，精子活力、数目出现异常，导致雄性不育不孕。由此可见，睾丸支持细胞是研究雄性生殖系统毒性的范细胞。本试验通过研究ZEA对体外培养的睾丸支持细胞增殖相关基因Vimentin、CCND1表达以及氧化应激酶（SOD，GSH-PX）的影响，探讨ZEA对雄性动物生殖功能的毒性作用和机理。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　24日龄左右的清洁级雄性SD大鼠（南京市江宁区青龙山动物饲养场），ZEA（Sigma公司），DMEM/F12培养液，PBS缓冲液（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），胶原酶I（MP Biomedicals），胎牛血清（Gibco公司），Tris-HCl（Sigma公司），细胞培养箱（Thermo公司），Real-time PCR Master Mix （TaKaRa公司），二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司），TRIzol （TaKaRa公司），SYBR Green Master Mix（Vzayme公司），MTT检测试剂盒（杭州碧云天），油红O染料；超氧化物歧化酶（SOD）；GSH-PX检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液（杭州碧云天公司），寡核苷酸引物由南京金维智有限公司合成。 　　1.2 原代大鼠睾丸支持细胞分离和培养[6-7] 　　采用颈椎脱臼法处死大鼠，将其全身浸泡于消毒乙醇后于无菌条件下取出睾丸，放入预冷的PBS中，剥离被膜、血管，随后PBS液冲洗2次。用眼科剪将曲细精管剪成约 1 mm3 碎块，转移至15 mL 离心管中；加入0.25% 胰酶和 0.1% 胶原酶Ⅰ各2 mL，37 ℃ 水浴振荡消化约30 min（观察到组织碎块消化至黏液状为准），加入2 mL含有血清的培养基吹打均匀，经100 μm筛网过滤后离心，去除上层清液。PBS洗1次后加入培养基 （DMEM/F12、15%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 U/mL），吹打细胞成细胞悬液；台盼蓝染色，计算细胞数，调整细胞密度为 3×105～5×105个/mL，接种于六孔培养板中，置于 CO2培养箱培养（95% 空气和 5% CO2，温度37 ℃），48 h后加入适量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）处理少许附着生精细胞，继续培养备用，隔天换液 1 次[8]。 　　1.3 油红O染色鉴定支持细胞[9]