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滇龙胆乙酰CoA转移酶基因克隆与表达分析 　　摘要：根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物，使用逆转录PCR（RT-PCR）技术从滇龙胆幼叶扩增该基因，并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明：GrAACT基因（登录号KJ917163）开放阅读框长 1 215 bp，编码404个氨基酸；GrAACT蛋白相对分子质量41.41 ku，pI值为6.25，属于AACT蛋白家族成员，无信号肽，为疏水稳定蛋白，主要由α-螺旋、无规则卷曲构成；GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域：硫解酶N端结构域（第12～272位氨基酸）、硫解酶C端结构域（第282～402位氨基酸）、类硫解酶结构域（第13～403位氨基酸）；在硫解酶C端结构域中，包含硫解酶保守位点（第350～366位氨基酸）、硫解酶活性位点（第385～398位氨基酸）；滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近；GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为6741 ku；组织特异性表达分析结果表明，GrAACT基因主要在茎、根中表达。 　　关键词：滇龙胆；乙酰CoA酰基转移酶；基因克隆；生物信息学分析；表达分析 　　中图分类号： S184；R282.71；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0094-05 　　收稿日期：2015-05-27 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；国家科技支撑计划（编号：2011BAI13B02-04）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（编号：2015Z171）。 　　作者简介：张晓东（1980―），男，河南新郑人，博士，副教授，从事植物代谢基因工程研究。E-mail：zxd95@126.com。 　　通信作者：王元忠，硕士，助理研究员，从事药用植物资源评价与利用的研究。E-mail：boletus@126.com。滇龙胆是传统中药龙胆的来源植物之一，也是云南省重要道地药材，主要分布于中国西南部，尤其是云南省山区地带；其根入药，用于治疗各种炎症、肝炎、风湿病和胆囊炎等[1]。目前，医用龙胆需求量每年递增约10%，而现有滇龙胆产量低、品质不高，且野生滇龙胆资源遭到人为大肆采挖[2]。为选育优质、高产、高抗新品种，2013年6月云南省已启动龙胆草航天育种工程[3]。从中医药现代化角度来看，滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷，要从根本上解决龙胆草药源问题并保护野生滇龙胆，除筛选新品种之外，还必须弄清龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机理，为通过基因工程手段生产龙胆苦苷奠定基础。 　　龙胆苦苷为裂环烯醚萜类化合物，在植物中主要通过质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）、胞质甲羟戊酸（MVA）途径合成[4]。乙酰CoA酰基转移酶（又称乙酰乙酰CoA硫解酶，AACT，EC ）是MVA途径中的第1个限速酶，能够催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[5]。目前，乙酰CoA酰基转移酶基因AACT已从拟南芥[5]、丹参[6]、胡萝卜[7]、白木香[8]、油茶[9]等许多植物中分离。AACT基因表达具有组织特异性，并被生物、非生物因素诱导。拟南芥中存在2个平行进化的同源基因，其中AtAACT1主要在维管系统中表达，AtAACT2则在根尖、幼叶、茎上部和花药中大量表达，二者存在功能冗余；AtAACT2的作用是为胞质定位、MVA起源的异戊烯萜类生物合成途径合成大量乙酰乙酰CoA前体[5]。在生物诱导剂（100 mg/mL酵母提取物）、非生物诱导剂（30 mmol/L Ag+）共同诱导下，丹参SmAACT基因在诱导后12 h的表达量达到最高值[10]。 　　目前，由于龙胆基因组资源极度匮乏[11]，导致龙胆苦苷生物合成途径并不清楚[3]。本研究根据笔者实验室滇龙胆转录组数据库中的GrAACT基因序列，设计特异性引物，通过逆转录PCR（RT-PCR）技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到GrAACT基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析，以期为阐明滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　滇龙胆组培苗、盆栽苗均采自玉溪师范学院分子生物学实验室，经云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl）。基因克隆所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶，基因组织特异性表达分析所用材料为盆栽3年生滇龙胆的根、茎、叶，采样日期为2014年5月17日。 　　1.2方法 　　按照多糖植物组织提取试剂RNAiso（TaKaRa，大连）说明书提取滇龙胆幼叶总RNA；按照逆转录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书合成cDNA。根据原核表