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阿勒泰羊脂肪酸合成酶及脂蛋白酯酶基因序列分析 　　摘要：以阿勒泰羊为研究对象，对脂肪酸合成酶（FAS）基因、脂蛋白酯酶（LPL）部分编码区的cDNA进行克隆、测序，与GenBank中已收录的其他11种动物的FAS、LPL基因序列进行同源性分析，并构建分子进化树。结果显示，所克隆的FAS、LPL基因与绵羊的基因序列同源性最高，分别为99.61%、100.00%；FAS基因与虎鲸同源性最低，为46.24%；LPL基因与罗非鱼的序列同源性最低，为56.28%。结果均正确地反映了物种间的进化关系，序列分析结果为人们进一步对阿勒泰羊脂肪的相关研究、肉质性状的研究及育种提供了理论基础，同时也为阿勒泰羊FAS、LPL基因的生物学功能、遗传进化研究提供了分子依据。 　　关键词：硬脂酰辅酶A去饱和酶；脂肪酸合成酶；脂蛋白酯酶；序列分析；阿勒泰羊 　　中图分类号： S811.3；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0043-03 　　新疆阿勒泰地区位于中国西北边陲，冬季长达半年，许多优良绵羊品种无法适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，而阿勒泰羊以其全身肌肉丰满、体型肥硕、尾根附近沉积大量脂肪、耐粗饲、抗寒性强等特点，能够适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，成为当地的优良类群[1]。脂肪酸的合成是由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成甘油三脂（TAG）[2]，FAS表达水平的高低能够直接影响甘油三脂在体内的沉积[3]，因此FAS是脂肪酸合成代谢的关键酶。Hsu等分离得到人脂肪酸合成酶代谢调控基因，发现人的脂肪酸合成酶基因位于17q25[4]。Kameda等对鹅脂肪酸合成酶代谢调控基因作了研究，发现脂肪酸合成酶代谢调控基因全序列长度大约有 50 kb，同时现已知牛的基因位于19q22、鸡的基因位于18号染色体上[5]。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是机体脂质和脂蛋白代谢的关键酶，是分解循环脂蛋白中乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯，释放出脂肪酸和甘油的限速酶[6]，作为影响脂肪沉积的一个重要遗传标记，研究LPL表达水平对加快肉品质改进速度具有重要的意义。本研究对阿勒泰羊的FAS、LPL基因部分片段进行了克隆、测序，并与已报道的其他物种的相应基因进行序列分析，以期在分子水平的基础上为家畜的改良育种提供理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　选择新疆福海县5只健康成年的阿勒泰羊，采集阿勒泰羊颈部肌间脂肪、胸部肌间脂肪、腹部肌间脂肪、腿部肌间脂肪、尾部脂肪、肝脏等6个部位的组织，立即放入液氮罐速冻，转入-80 ℃冰箱中保存。 　　TRIzol、DEPC、DNA marker、Taq PCR Master Mix，购自天根生物科技服务有限公司；PrimeScript@RT reagent kit反转录试剂盒（批号：RR047A），购自TaKaRa公司（批号：DRR420A）；DNA凝胶回收试剂盒（批号：DP209-02）、胰蛋白胨、琼脂粉、琼脂糖、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇，购自北京华美生物工程公司；感受态细胞E.coli DH5α由石河子大学动物科技学院传染病实验室保存。 　　1.2试验方法 　　1.2.1目的基因引物设计以GenBank中已发布的绵羊FAS基因（登录号：NM_001009254.1）、LPL基因（登录号：NM_001009394.1 ）为模版，用Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京六合华大基因有限公司合成。FAS基因上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′；目的片段长度为256 bp。LPL基因上游引物：5′-GATTAGCGATTCCTACTTCAGC-3′；下游引物：5′-AGACTTGTCATGGCATTTCAC-3′；目的片段长度为181 bp。 　　1.2.2RNA的提取利用TRIzol一步法提取试验样品的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，于-70 ℃保存备用。然后依次加入以下试剂：1 μg RNA、10× Reaction buffer、1 μL MgCl2、1 μL DNase Ⅰ（RNase-free），用DEPC处理水补足至10 μL，除去存在的少量基因组 DNA。于37 ℃反应 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃孵化10 min，即可用此RNA作为反转录模板。以RNase-free水为对照，用紫外分光光度计测定D260 nm/D280 nm值、总RNA浓度。 　　1.2.3反转录向提取纯化好的各组织的总RNA中加