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阿卡波糖对糖尿病患者肠道双歧杆菌影响 　　【摘要】 目的：探讨阿卡波糖对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）患者肠道菌群的影响。方法：2型糖尿病患者68例，随机分为A组（阿卡波糖治疗，34例）和B组（未服阿卡波糖，34例），利用荧光定量PCR方法测定粪便中双歧杆菌变化。结果：经3个月干预治疗，两组双歧杆菌数量均较前升高，但阿卡波糖的双歧杆菌数量升高程度更加显著，比较差异有统计学意义（P0.05）。结论：阿卡波糖能增加肠道双歧杆菌数量。 　　【关键词】 2型糖尿病； 阿卡波糖； 肠道双歧杆菌 　　有研究表明，2型糖尿病患者存在菌群失调，表现为粪便中肠杆菌科细菌增加，而双歧杆菌和类杆菌数量减少，服用阿卡波糖的患者肠道内类杆菌数量进一步减少，双歧杆菌和肠杆菌科细菌有所恢复[1]，因此推测，阿卡波糖可能通过改变肠道菌群，提高肠道有益菌群的含量、减轻缓解糖尿病。本实验旨在探讨阿卡波糖干预治疗对2型糖尿病患者肠道菌群中双歧杆菌数目的影响。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 选取符合1999年WHO诊断标准的2型糖尿病患者68例，随机分为两组：A组（34例）给予阿卡波糖50 mg 3次/d口服，B组（34例）给予除阿卡波糖外的降糖药，最终血糖控制相当。两组患者均无胃肠道疾患，近2周内未用过抗生素，近1个月内未用过葡萄糖苷酶抑制剂。两组在病程、年龄、BMI、血脂、血压等方面比较，差异无统计学意义（P0.05），具有可比性。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本收集 两组患者分别于入院时和治疗3个月后留取粪便，于-80 ℃冰箱保存待测，利用荧光定量PCR方法测定人肠道双歧杆菌数目的变化。 　　1.2.2 主要仪器设备及试剂 低温高速离心机：德国Heraeus公司。紫外分光光度仪：美国SHIMADZU公司。双歧杆菌：购自辽宁生物医药公司。RT-PCR试剂盒：购自大连宝生物工程有限公司。引物由TaKaRa大连宝生物公司合成。 　　1.2.3 双歧杆菌提取及PCR定量分析法 　　1.2.3.1 DNA提取 取大便0.2 g加9 ml的磷酸盐缓冲液充分颠倒混匀5～10 min，然后低速离心（200 r/min）5 min取上清，上述过程重复3次，收集上清高速离心（9000 r/min）3 min后取沉渣，沉淀的细菌用PBS液洗4次，水洗1次，后加蒸溜水悬浮细菌及溶菌酶破碎细胞壁，按TaKaRa试剂盒步骤提取DNA于-20 ℃保存待测。 　　1.2.3.2 PCR引物对设计 如下。 　　1.2.3.3 标准曲线的建立 将双歧杆菌16S目的基因PCR产物克隆到Pmd18-T Vector（TaKaRa Code No.D101）上，纯化质粒，以HindⅢ限制酶进行线性化处理，得到质粒DNA标准品，再用灭菌三蒸水行10倍系列稀释，作为标准品，进行SYBR Green为荧光染料的实时定量PCR反应。PCR反应体系（TaKaRa Code.TP800）为25 μl，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。反应完毕后进行溶解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃15 s，共1个循环。根据读取的荧光数据，由系统软件iCycler Optical SystemInterface software（v2.0，Bio-Rda）自动分析Ct值，生成标准曲线，扩增曲线及溶解曲线。 　　1.2.3.4 待检粪便样品16SrDNA的定量分析 将待检粪便样品中提取的DNA分别进行两种细菌的16SrDNA荧光定量PCR反应，反应体系与反应条件与标准曲线制备时相同。每次实验同时设标准品校正和ddH2O代替DNA模板的阴性对照，每个样品均同时做3个平行复孔，反应完毕后根据溶解曲线分析PCR产物的特异性。 　　1.3 统计学处理 统计学分析应用SPSS 16.0软件，细菌数量采用秩和检验，指标用中位数及四分位数间距表示，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 两组干预前后血糖检测指标比较 干预治疗前两组患者空腹血糖水平、餐后血糖、糖化血红蛋白比较差异均无统计学意义（P0.05），具有良好的可比性。见表1。 　　2.2 3个月后两组肠道双歧杆菌数量及检验结果 干预治疗前两组双歧杆菌数目比较差异无统计学意义（P0.05），干预治疗后A组双歧杆菌数目较B组增加明显，比较差异有统计学意义（P0.05）。见表2。 　　3 讨论 　　近年来，越来越多证据表明肠道菌群参与控制机体体质量和能量代谢，与肥胖、2型糖尿病的发生与发展密切相关[2-3]。肠道菌群是一个复杂的细菌群体，可以看作是人体内的一个“微生物器官”，在人体内发挥着重要