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鸡马立克氏病疫苗鸡胚免疫技术应用 　　摘 要：目的：通过不同的马立克氏病（Marek’s disease，MD）疫苗接种方法的比较，得出获得最佳免疫效果的免疫方法。方法：选取孵化示范基地，孵化5组试验鸡群，每组100羽，试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫+17日龄二免、鸡胚免疫+出生二免、空白对照，自60日龄起对试验鸡群抽样开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。结果：与对照组相比，4个疫苗免疫组的血清抗体效价、IFN-γ、IL-4水平均显著升高，同时MD的发病率显著下降，其中，以18日龄鸡胚免疫和鸡胚免疫+出生免疫效果最为显著。结论：鸡胚免疫技术能有效提高鸡马立克氏病疫苗的免疫效果。 　　关键词：鸡；马立克氏病；鸡胚免疫 　　中图分类号：S831.7 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180431003 　　鸡马立克病是由马立克病病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起鸡的一种传染性肿瘤病，主要以各组织器官、神经、皮肤及虹膜和性腺形成肿瘤和淋巴组织增生为特征[1]。由于MDV可通过空气传播，且感染的鸡很快发病死亡，给养殖业带来了巨大的经济损失，MD是鸡的重要疫病之一，受到了国内外的重视。MD是目前已知的唯一可用疫苗成功预防的病毒性肿瘤疾病，无特效药物治疗，只能预防。但近年来发现，免疫鸡群往往由于早期感染，导致免疫失败，由于鸡胚发育后期的组织学基础研究[2] 和MD 鸡胚免疫保护效果[3，4] 的研究都表明，鸡胚在孵化后期已具备能够产生一定程度的免疫应答的组织基础。因此，本文用鸡胚免疫并结合常用的免疫方法对试验基地的鸡群进行试验，以期获得最佳的鸡马立克病疫苗免疫方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 种蛋 　　该试验是以溧阳市南渡宏伟种禽养殖场、南渡仁福养鸡场、南渡福兴苗禽有限公司3家规模种禽养殖（孵化）场为示范基地，共孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。 　　1.1.2 疫苗 　　试验组均免疫接种鸡马立克氏病Ⅰ+Ⅲ型二价活疫苗（CVI988+FC126株），按照0.2mL/枚的量接种。 　　1.2 鸡胚孵化 　　试验所用的鸡胚在孵化之前用甲醛熏蒸消毒30min，37.5～38.5℃孵化，湿度62%，每小时翻蛋1??，使用大型电气自动孵化器孵化。 　　1.3 试验分组及免疫方法 　　本项目是在示范基地，孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫+17日龄二免、鸡胚免疫+出生二免、空白对照。自60日龄起对试验鸡群采血开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。每组随机抽取10羽鸡，通过试验检测数据分析，制定合理的鸡马立克氏病免疫方法并推广应用。 　　1.3.1 第1组：出生1日龄免疫 　　刚出生的仔鸡，进行胫部外侧肌肉注射稀释好的鸡马立克氏病Ⅰ+Ⅲ型二价活疫苗0.2mL/枚。 　　1.3.2 第2组：18日龄鸡胚免疫 　　孵育至18日龄的鸡胚，用碘酊和酒精消毒鸡卵钝端的气室，6号针头在中央打孔，然后用5号注射器垂直进针，刺入全部针长注射二价活疫苗疫苗0.2mL/枚，最后用石蜡封口，继续常规孵化。 　　1.3.3 第3组：出生免疫+17日龄二免 　　将试验组的鸡群在出生和17日龄时均进行胫部外侧肌肉注射二价活疫苗，0.2mL/羽。 　　1.3.4 第4组：鸡胚免疫+出生二免 　　孵育18日龄后同上鸡胚免疫，0.2mL/枚；出生一日龄时胫部外侧肌肉进行二免，0.2mL/羽。 　　1.3.5 第5组：未免疫的对照组 　　1.4 试验室检测 　　1.4.1 间接ELISA法检测鸡马立克氏病病毒血清抗体 　　采用商业化的MDV血清抗体间接ELISA检测试剂盒，在酶标板条微孔上预包纯化的鸡MDV的抗原。一定时间后，加入稀释后的待检血清，经过温育后，血清样品中MDV的抗体与包被板上的抗原特异性的结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入HRP标记的兔抗鸡IgG酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。吸光度A值与样品中鸡马立克氏病病毒抗体成正相关。 　　1.4.2 各试验组鸡血清IFN-γ水平检测 　　IFN-γ由1型辅助性T细胞（Th1细胞）分泌产生，主要参与细胞免疫。因此血清中的IFN-γ水平，可以间接反映试验动物的细胞免疫水平。 　　应用双抗体夹心法测定标本中鸡γ干扰素（IFN-γ）水平。用纯化的鸡IFN-γ 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包