黄芩苷对胃癌BGC―823MGC―803细胞迁移能力影响.docVIP

黄芩苷对胃癌BGC―823MGC―803细胞迁移能力影响 　　摘要：目的 观察黄芩苷对胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移的影响，探讨其可能的作用机制。方法 划痕实验和Transwell小室观察Toll样受体（TLR）激活后以及黄芩苷干预TLR激活后胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移能力；RT-qPCR和Western blot检测胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、激活蛋白-1（AP-1）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果 脂多糖（LPS）可促进胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移，黄芩苷可抑制LPS干预后胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移；LPS可上调TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达，黄芩苷可下调LPS干预后胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达。结论 黄芩苷可阻断TLR4-AP-1-VEGF的激活，从而抑制胃癌BGC-823、MGC-803细胞的迁移。 　　关键词：脂多糖；Toll样受体；黄芩苷；迁移；胃癌 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.017 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0064-05 　　炎症与肿瘤关系密切，慢性炎症与25%以上癌症的发生相关，参与肿瘤的发生、发展，促进肿瘤的侵袭与转移[1]。胃癌的发生与慢性炎症密切相关，“Hp感染-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-胃癌”是典型的炎症与癌症相关的例子。寻找一种既抗炎又抗肿瘤的药物是抗肿瘤研究的重要方向。黄芩苷是唇形科 　　植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的一种黄酮类化合物。研究表明，黄芩苷有抗肿瘤[2]、抑菌抗炎[3]等药理作用。脂多糖（LPS）是Toll样受体（TLR）的外源性配体，能激活TLR的核因子（NF）-κB及激活蛋白-1（AP-1）等信号通路，引起多种细胞的炎症反应[4]。本实验采用LPS干预胃癌BGC-823、MGC-803细胞激活TLR，观察LPS对胃癌细胞转移能力的影响，并用黄芩苷加以干预，观察黄芩苷对胃癌细胞侵袭转移能力的影响，初步探讨其可能的作用机制，为黄芩苷治疗炎症相关性肿瘤提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞株 　　胃癌MGC-803、BGC-823细胞，中国科学院上海生命科学研究院。 　　1.2 药物与试剂 　　黄芩苷，南京狄尔格医疗器械有限公司，CAS号21967-41-9。高糖DMED培养基，健顺生物公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；Maker和Transwell小室，Thermo scientific公司；反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒，大连宝生物公司，引物均由大连宝生物公司合成；一抗TLR4、AP-1、血管内皮生长因子（VEGF）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）购自Affinity公司，二抗购自碧云天公司。 　　1.3 主要仪器 　　光学显微镜（日本Nikon公司），超净工作台（苏静安泰），CO2培养箱（Thermo公司），微量移液枪（日本立洋），TGL-16G离心机（上海医疗器械七厂），低温离心机（Beckman公司），电泳仪（北京六一仪器厂），微量上样器（上海生工生物工程有限公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 细胞培养 　　用含10%FBS高糖DMEM，加青霉素、链霉素（100 U/mL），37 ℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养胃癌MGC-803、BGC-823细胞。每隔2 d换完全培养基，待细胞密度达90%时按1∶2比例传代。取对数生长期细胞用于下一步实验。 　　2.2 划痕实验 　　将对数生长期细胞接种于预先底部画线的6孔板，待细胞贴壁生长至满，用10 μL无菌枪头垂直于底部划线性划痕，PBS漂洗3次去除脱落细胞，再用无血清培养液[分为对照组（只加培养液）、LPS组（1、10、100、1000、10 000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组]干预，继续培养。划痕后0、12、24、36 h随机选择划痕区3个视野拍照，比较各组间划痕愈合的差异，用愈合率代表细胞迁移能力。计算细胞愈合率[（愈合前细胞间空白区域面积-愈合后细胞间空白区域面积）÷愈合前细胞间空白区域面积×100%]。 　　2.3 Transwell小室实验 　　将对数生长期细胞饥饿12 h后，按5×105个/mL细胞的密度接种于24孔培养板内的Transwell小室中，置于培养箱中继续培养至细胞贴壁后，吸出小室中培养液，换新的无血清培养基[分为对照组（只加培养液）、LPS组（