2015毛细管电泳课件.ppt

* 第一节 概述 电泳（Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳发展成为分离技术应归功于Tiselius (瑞典,蒂塞利乌斯)的工作。他于1937年建立“移界电泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋白、α、β、和γ球蛋白，这项工作成为蛋白质化学发展的基础，因此Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。 第15章 毛细管电泳法 电泳（ C）槽和电极（ V1、V2 ） * 经典电泳法散热差，分离电压受到限制。 1981年，Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管电泳发展史上具有划时代意义的工作，他们采用75μm内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到40万个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了基础。 James W. Jorgenson North Illinois University 化学系教授 * 第二节 基本原理 电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场中定 向移动的现象。 电泳淌度：单位电场强度下，带点粒子的电泳速率。 式中 －电泳迁移率（电泳淌度）， 为电泳速率 一、电泳和电泳淌度 电泳淌度与带电粒子半径（r）及电荷（q）间的关系 电泳淌度的差异构成了电泳分离的基础 * 二、电渗和电渗淌度 电渗（electroosmosis)是毛细管电泳分离理论中最基本的概念之一。 * 电渗是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，电解 质溶液朝一个方向迁移的现象。电渗速率 与固液两相界面 的双电层Zeta电位 ，缓冲溶液的介电常数 和黏度 有关， 与电场强度成正比。 单位场强下的电渗速率 ，称为电渗淌度 * 1)CE中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动,电渗流的流动为平流,塞式流动（谱带展宽很小）； 高效液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。 四、柱效和分离度 * 2） CE中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： 阳离子运动方向与电渗流一致； 阴离子运动方向与电渗流相反； 中性粒子运动方向与电渗流一致； （1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速； （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在CE中，控制电渗流非常重要。 * 3)无涡流扩散项与传质阻力项 在HPCE中，仅存在纵向扩散，H=B/u 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。 影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算： 为两组分电泳淌度的差值 * 第三节 毛细管电泳仪和实验操作 一、毛细管电泳仪 * 1.高压电极槽和进样机构 2.填灌清洗机构 3.毛细管 4.检测器 5.铂丝电极 6.低压电极槽 7.恒温系统 8.数据记录处理系统 自动型毛细管电泳仪结构示意图 * CE的要求： ▲进样机构不存在死体积，能进行精确的进样控制。 ▲需有毛细管清洗机构。 ▲高压电源至少应能输出200μA×25kV的功率。 ▲检测器尽量安装在接地端，优先考虑柱上紫外检测方式。 ▲ 温控范围宽，以0 ℃为界，越宽越好，上限不应低于50 ℃ ，最好能达到65～70 ℃ ，至少能在20～40℃内恒温，恒温精度应小于±0.1 ℃ 。 * 高压电源一般采用（0 ~±30）kV连续可调的直流高压电源，一般要求电压稳定在±0.1%。电极通常由直径0.5mm ~1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml ~ 5ml不等），以便于密封。 仪器必须接地，操作过程中必须注意高压的安全保护。 一、高压电源 * 二、毛细管 1.尺寸 毛细管尺寸的选择与分离模式和样品有关。自由溶液电泳多选用50或75μm内径的毛细管，分离的有效长度常控制在40～100cm之间。如进行大颗粒如红细胞的分离，则需要内径大于 300μm的毛细管。CGE或CEC的有效长度一般控制在20cm左右。 2.涂层 外壁涂一层聚酰亚胺保护层