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芝麻枯萎病菌毒素主成分结构和特性分析 　　摘要：芝麻枯萎病是芝麻主要病害之一，由尖孢镰刀菌芝麻专化型侵染引起。为探明芝麻枯萎病菌产毒类型，试验采用高效乙酸乙酯萃取法，对尖孢镰刀菌株HSFO07021菌液进行了粗毒素提取；采用中压制备色谱仪，首次成功分离了尖孢镰刀菌芝麻专化型3种主要毒素。结构鉴定显示，尖孢镰刀菌芝麻专化型的3种毒素分别为镰刀菌酸、9，10-脱氢镰刀菌酸和10-羟基镰刀菌酸。种子处理结果表明，尖孢镰刀菌芝麻专化型产生的镰刀菌酸和9，10-脱氢镰刀菌酸均能抑制芝麻幼苗的茎叶生长和根部伸长，对幼苗产生毒害；镰刀菌酸的毒性强于9，10-脱氢镰刀菌酸。 　　关键词：芝麻；尖孢镰刀菌芝麻专化型；镰刀菌酸；9，10-脱氢镰刀菌酸；分离 　　中图分类号： S435.653文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0082-05 　　芝麻为胡麻科胡麻属植物，是世界上最古老的特色油料作物之一，也是我国重要的优势农产品[1]。芝麻籽粒富含不饱和脂肪酸和维生素E[2-4]，并富含木酚素等多种生物活性物质，对人体健康非常有益。但是在实际生产中，芝麻易受病害、渍涝等因素侵袭，产量与品质均受影响。芝麻枯萎病是由尖孢镰刀菌芝麻专化型（Fusarium oxysporum f. sp. sesami，FOS）侵染引起的1种真菌病害[5-6]。研究表明，尖孢镰刀菌在生长代谢过程中能够产生毒素（例如镰刀菌酸），对寄主植物有强烈的毒害作用[7-8]。在香蕉枯萎病菌株培养液中，发现有镰刀菌酸（FA）等多种毒素成分存在[8]，镰刀菌酸可导致香蕉表现枯萎症状，而其他毒素成分则在致枯萎过程中起了增效作用，加速了植株枯萎。Wu等研究表明，尖孢镰刀菌侵染时所产生的镰刀菌酸能够引起西瓜的氮素代谢紊乱；此外研究也显示，枯萎病菌毒素是较为普遍存在的一类毒素，成分复杂，对农作物生产和食品安全有重要影响[9]。Smith等从猪饲料、干玉米、高水分谷物、小麦、大麦中均不同程度地检测出了镰刀菌酸的存在[10]。近期研究表明，芝麻枯萎病菌亦能产生镰刀菌毒素（统称为FOS毒素），主要成分应包括镰刀菌酸（FA）以及FA-H2、FA+O和FA+O2等3种镰刀菌酸类似物[11]。但是受毒素提取纯化技术的限制，目前尚未获得各毒素纯品；芝麻枯萎病菌各主要毒素的特性如何尚不得而知。以往研究结果显示，为获得镰刀菌毒素，人们多采用活性炭吸附法[12]、乙酸乙酯萃取法[13]从尖孢镰刀菌滤液中提取。Bani等使用乙酸乙酯萃取法，提取了尖孢镰刀菌粗毒素；随后采用硅胶板+乙酸乙酯-甲醇-水（体积比为8.5 ∶2 ∶1）流动相的分离条件，成功分离到了尖孢镰刀菌酸[14]。为此，本研究主要探讨芝麻枯萎病菌毒素主成分的制备和特性，首次获得了FOS毒素3个主成分的纯品，明确了毒素主成分对芝麻幼苗生长的毒害特点，为下一步开展芝麻枯萎病菌致病机理和防控技术研究奠定了技术和材料基础。 　　1材料与方法 　　1.1病原菌株及保存 　　选取尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株（编号：HSFO07021）开展毒素提取研究。菌株由河南省农业科学院芝麻研究中心病理室保存。 　　1.2仪器与试剂 　　毒素提取及分离用仪器设备主要包括：Waters 2695液相色谱仪（Waters公司，美国）、Waters LC150半制备液相色谱（Waters公司，美??）、液质联用质谱仪（UPLC-QTOF，xEVO G2，美国）、NICOLET 6700傅利叶红外光谱仪（赛默飞世尔公司，美国）、500 MHz Bluke核磁共振仪（布鲁克公司，德国）、离心机、分液漏斗、冻干机、真空旋转蒸发仪、布氏漏斗、真空抽滤机等。盐酸、乙酸乙酯等试剂均为分析纯（国产）。乙腈（TEDIA，America）、乙酸（国产）均为高效液相色谱纯度级别，水为纯净水级别。 　　1.3菌株培养 　　挑取HSFO07021菌株少量菌丝（-70 ℃保藏），接种在PDA平板培养基上，于28 ℃培养4 d。用无菌打孔器沿菌落边缘打出直径为8 mm菌片3～5个，接入装有250 mL PD培养液的500 mL三角瓶内，28 ℃、120 r/min振荡培养4 d。用灭菌纱布滤除菌丝，收集孢子液，用无菌水将所得孢子液浓度调至107个/mL孢子，作为接菌母液。取1 mL接菌母液，加入100 mL理查德培养液中，28 ℃、120 r/min振荡培养，用于毒素提取试验。5 d取样1次，用于检测培养液FA含量，共计45 d。 　　PDA培养基：马铃薯200 g（煮熟过滤），葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1 000 mL。PD培养液：马铃薯150 g（煮熟过滤），葡萄糖20 g，水1 000 mL。理查德培养液：KNO3 10 g，KH2PO4 5 g，Mg