超高效合相色谱法定性和定量分析补肾健脑颗粒.docVIP

超高效合相色谱法定性和定量分析补肾健脑颗粒 　　摘 要 用超高效合相色谱法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）建立补肾健脑颗粒及各药材提取物的指纹图谱，对补肾健脑颗粒主要色谱峰进行归属分析，并测定有效成分β-蜕皮甾酮和松果菊苷的含量。样品经乙醇提取后，进样1 μL，用Waters ACQUITY UPC2TM BEH柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）分离，柱温为40 ℃，以超临界CO2-0.05% H3PO4-甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.8 mL/min。分析补肾健脑颗粒和各药材提取物的UPC2指纹图谱，利用各峰相对保留时间、紫外光谱图及部分对照品归属主峰。结果表明，补肾健脑颗粒UPC2指纹图谱中15个主峰来源明确，其中12号峰为β-蜕皮甾酮，含量为380 μg/g， 15号峰为松果菊苷， 含量为9.562 mg/g。与HPLC和UPLC法相比，本方法简便、快速，精密度高，重现性好。 　　关键词 超高效合相色谱；补肾健脑颗粒；β-蜕皮甾酮；松果菊苷 　　1 引 言 　　补肾健脑胶囊临床上主要用于治疗儿童多动症，且疗效显著[1]。但该制剂存在工艺简单粗糙，服用量大，质量难以控制，小儿服用顺应性不好的缺点， 并且没有定性定量方法控制其质量。因此本研究在保证疗效的基础上将补肾健脑胶囊制成颗粒剂，克服了其服用困难的缺陷，并采用色谱法对该制剂进行定性与定量分析，以控制其质量。补肾健脑颗粒是由肉苁蓉、怀牛膝、远志、石菖蒲等药材经过提取、浓缩、干燥、粉碎、制粒工序制成的复方制剂。本研究用HPLC法和UPLC法分析补肾健脑颗粒，在多次优化色谱条件后，都不能将β-蜕皮甾酮和松果菊苷分离。因此，采用一种新的分离技术―超高效合相色谱（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）[2，3]，建立了补肾健脑颗粒及其组成药材的指纹图谱，归属分析了补肾健脑颗粒指纹图谱中主要色谱峰，并建立β-蜕皮甾酮和松果菊苷的含量测定方法，该方法能将β-蜕皮甾酮和松果菊苷有效分离，与HPLC和UPLC方法相比，更简便、快速，且分离度高，重复性好。本实验利用UPC2定性定量分析了补肾健脑颗粒，在复杂中药制剂质量控制方面提供了新的思路。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　2695高效液相色谱仪、2996PDA检测器（Waters公司）；ACQUITY超高效液相色谱仪、ACQ-PDA检测器（Waters公司）；ACQUITY超高效合相色谱仪、ACQ-UPC2-PDA检测器（Waters公司）；KQ-400DB超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；EYELAOSB-2100旋转蒸发仪（日本东京理化） 。 　　松果菊苷（MUST、β-蜕皮甾酮（MUST，均购自上海顺勃生物技术有限公司；乙腈（色谱纯，德国莫克公司）；H3PO4（分析纯，北京化工厂）；甲醇（分析纯，天津北方天医化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，山东禹王试剂公司）；纯净水（兰州大学第一医院生产）；补肾健脑颗粒（三批中试样品，由兰州中医院脑病康复医院提供）；肉苁蓉、怀牛膝、远志、石菖蒲药材由兰州黄河药市提供。 　　2.2 色谱条件 　　采用Acqtity UPC2 BEH 色谱柱；系统背压为1800 psi；色谱柱温度为40 ℃；柱流速为0.8 mL/min；进样量为1 μL；流动相分别为超临界CO2（流动相A）和0.05% H3PO4-甲醇溶液（流动相B），梯度洗脱：0～0.3 min，99% A；0.3～4 min，99%～90% A；4～16 min，90%～70% A；16～18 min，70%～60% A；18～20 min， 60% A；20～21 min，60%～99% A；21～25 min，99% A。检测波长248 nm。 　　2.3 对照品溶液的制备 　　称取松果菊苷对照品16.65 mg，加50%甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，得666 mg/L的松果菊苷对照品溶液。称取β-蜕皮甾酮对照品1.62 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，得32.4 mg/L β-蜕皮甾酮对照品溶液。 　　2.4 样品溶液的制备 　　补肾健脑颗粒制备： 按处方比例称取肉苁蓉、远志、怀牛膝、石菖蒲等适量，煎煮，收集滤液、浓缩、干燥、粉碎、加适量辅料制粒得补肾健脑颗粒。阴性样品制备：按上述方法分别制备缺肉苁蓉和缺怀牛膝的阴性样品。 　　药材提取物的制备： 按处方分别称取各药材适量，按照处方提取工艺提取，收集滤液，浓缩，干燥，得药材提取物。 　　2.5 供试品溶液的制备 　　分别取补肾健脑颗粒约1.0