蟾蜍转胶蛋白-2基因的克隆、生物信息学分析及其抗血清的制备-森林保护学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 摘 摘 要 万方数据 万方数据 摘要 蟾蜍基源的材料作为中药材使用具有悠久的历史，近几十年来的研究表明蟾 蜍皮肤中多肽类含量丰富，而多肽类中的抗肿瘤肽的研究正成为一个新的研究热 点，同时有报道显示这些药材具有良好的抗肿瘤效果。本文以日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)皮肤 cDNA 质粒文库和中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)皮肤第一 链 cDNA 为模板，进行转胶蛋白-2 (transgelin-2, TAGLN2) cDNA 的克隆，构建其 原核表达重组质粒并诱导和纯化其重组蛋白，以及制备相应的小鼠抗血清。本论 文主要取得如下结果： 1、通过菌落 PCR(polymerase chain reaction)从日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库 获得缺失部分 5′端序列 TAGLN2 的 cDNA 克隆(GenBank 登录号为 JX197456)， 长为 997 bp，包括 348 bp 的开放阅读框(open reading frame, ORF)、31 bp 的 5′端 非翻译区(untranslated region, UTR)及 618 bp 的 3′-UTR，编码由 115 个氨基酸残 基组成的 N-端截短型 TAGLN2。与其他物种的对应部分的同源性介于 71%-85%。 2、为克隆日本蟾蜍全长 TAGLN2 的编码基因，依据已克隆的 partial TAGLN2 的 cDNA 序列，设计上、下游引物 P1 和 P2，分别与自行设计的引物 XhoTT 和 日本蟾蜍皮肤 cDNA 质粒文库上游引物 SP6 组合，以上述文库为模板实施第一 轮 PCR，获得多个含有完整 5′-或 3′-UTR 的 TAGLN2 相关克隆。在此序列基础 上，再次设计引物 P3 和 P4 (分别含 5′-或 3′-UTR 末端部分序列)，各自与 XhoTT 和 SP6 组合，实施第二轮 PCR。共获得 26 个克隆，其中最长序列 (GenBank 登 录号为 KC820703) 1 267 bp，包括 594 bp ORF、86 bp 5′-UTR 和 587 bp 3′-UTR。 多数克隆均有全长 ORF，编码由 197 个氨基酸残基组成的完全相同的全长 TAGLN2。但发现不同克隆间的 5′-UTR 长度有很大差别，少数克隆甚至缺失部 分 5′-端序列，与 partial TAGLN2 情况相似。此外，还发现单核苷酸多态性位点 和碱基的插入或缺失现象，显示 TAGLN2 基因多样性。同源性分析表明，与其他 物种的同源性介于 71%-78%。 3、因后续研究中需使用中华大蟾蜍开展相应工作，本论文制备其皮肤第一 链 cDNA 以及在日本蟾蜍 TAGLN2 cDNA 序列的基础上设计引物 P3 和 P4，通过 PCR 获得编码中华大蟾蜍 TAGLN2 的转录子(GenBank 登录号为 KF432856)。该 I cDNA 长 1 207 bp，其 5′-UTR、3′-UTR 和 ORF 分别为 16 bp、597 bp 和 594 bp， 编码由 197 个氨基酸残基组成的蛋白质，与日本蟾蜍的 TAGLN2 仅有一个氨基 酸不同。 RT-PCR 组织分布检测表明 TAGLN2 在所检测的中华大蟾蜍各器官均 有表达，在肺、肝和肾中表达量较多。 4、将纯化的 TAGLN2 重组蛋白免疫小鼠，制备抗血清，并通过间接 ELISA 方法和 Western blotting 检测鼠抗蟾蜍 TAGLN2 抗血清。结果表明该抗血清效价 为 1：60 000 并具有良好特异性，符合酶联免疫检测要求。首次制备识别日本蟾 蜍 TAGLN2 的抗血清，为进一步研究 TAGLN2 的生物学功能及分析该蛋白在蟾 蜍机体中的表达奠定基础。 关键词：日本蟾蜍，中华大蟾蜍，转胶蛋白-2，重组蛋白，抗血清 II 万方数据 万方数据 ABSTRACT ABSTRACT Bufo-origin materials have long been used in traditional Chinese medicines and many studies have indicated abundant bioactive polypeptides included in Bufo skin and their anti-tumor curative effects. The objective of the current study is to clarify the bioactive polypetides included in Bufo-origin materials by cloning cDNA