仿刺参肠道组织多肽的制备及抗氧化活性研究-食品工程专业论文.docxVIP

上海海洋大学 硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 郭承华 烟台大学 教授 主席 孙虎山 鲁东大学 教授 委员 邱盛尧 烟台大学 教授 委员 答辩地点 山东省海洋资源与环境研究院 答辩日期 2015.6.5 II 仿刺参肠道组织多肽的制备及抗氧化活性研究 摘 要 本课题以仿刺参肠道组织为原料，首先对其营养成分进行测定，继而选用单 因素法及响应面法对木瓜、风味还有复合蛋白酶这三种蛋白酶进行酶解工艺优化。 对得到的不同分子量肽段的梯级肽进行化学抗氧化性研究及细胞损伤保护作用， 最后以得率和活性为目的分离纯化多肽。 主要研究内容如下： 1. 仿刺参肠道组织基本营养成分的测定 仿刺参肠道组织作为海参加工过程中的副产品，蛋白含量丰富，其粗蛋白含 量达到 63.056g/100g。可作为制备多肽的原材料。 2.仿刺参肠道组织酶解工艺条件优化 首先综合考虑生产可行性、产品安全性、产品风味鲜香等因素，筛选蛋白酶 的种类，以酶解时间、酶解温度及加酶量三个因素对酶解条件进行优化，利用响 应面法确定最佳酶解工艺条件。最后以木瓜蛋白酶在温度 50.10℃、时间 2.84h、 加酶量 2.639 万 U 条件下实际水解度达到 41.82%。 本实验采用的三种外源中性蛋白酶，结合仿刺参肠道组织中自身溶解酶，形 成的多酶体系，结果表明其酶解工艺条件优化合理有效，在安全的基础上不仅提 高了水解度，而且得到了颜色鲜亮状态澄清均匀且风味鲜香浓郁的酶解液，其可 利用作为开发风味独特的功能性食品。 3.梯级肽的分离制备及活性研究 本实验通过优化超滤的步骤，采用梯度稀释法，木瓜蛋白酶为活性酶，分离 仿刺参肠道组织的酶解液。结果表明经过四次超滤，小于该膜包的多肽已基本滤 过完全，达到了分离纯化的目的。实验共得到四个分子量大小范围的多肽，即小 于 650、650～1 000、1 000～10 000 及大于 10 000 u 这 4 个肽段的多肽，命名为 T3、T2、T1、T0，其含量分别为 95.32%、2.57%、1.70%、0.41%。 在对 T1、T2、T3 的化学抗氧化性的测定中，结果显示：T1、T2、T3 都具备 非常不错的清除 DPPH 自由基，抗超氧阴离子以及清除羟自由基的能力，且在一 定范围内，样品的清除即抗化学氧化能力的大小与浓度呈正相干。其中，T3 清除 I DPPH 自由基及抗超氧阴离子能力优于 T1 及 T2，而抗羟基自由基能力 T3 与 T2 的抑制能力相当并高于 T1。 对分离得到的仿刺参梯级肽进行原代巨噬细胞或氧化氢损伤保护能力检测， 通过过建立 H2O2 损伤原代巨噬细胞模型，选取 H2O2 的浓度为 160 μmol/L，利用 MTT 法检测各肽段样品对原代巨噬细胞的 H2O2 损伤保护作用，其结果表明，各肽 段样品均具有明显的细胞损伤保护能力，其中 T3 肽段保护效果更佳。 4.仿刺参肠道组织多肽纯化及分析 本实验利用大孔吸附树脂层析法，对超滤所得到的 T3 肽段进行的进纯化分离， 并对分离的组分进行抗氧化性检测，测定其分别清除 DPPH 自由基和超氧阴离子 的能力。T3 大孔吸附树脂层析分离所得 5 个成分即 F1、F2、F3、F4 和 F5，含量 分别为 5.657%、29.032%、16.543%、32.862%、15.682%，通过测定清除自由基能 力及得率综合分析，选用 F2 作为进一步分离纯化。 本实验通过高速逆流色谱，对大孔吸附树脂分离所得的 F2 组分进行进一步的 分离纯化，用于高速逆流色谱的各个溶剂，甲基叔丁基醚：正丁醇：乙腈：1%三 氟乙酸=2:1:1:5，F2 肽段分离出的的各个峰，命名为 F2-1、F2-2、F2-3、F2-4，含 量分别为 52.448%、15.233%、9.348%、15.035%。测定 4 个组分的抗化学氧化能 力，F2-1 呈现出明显的清除含羟基自由基的能力，而 F2-4 的拮抗超氧阴离子的能 力较强。 关键词：仿刺参肠道组织，酶水解，多肽，纯化，化学抗氧化，细胞保护 II Preparation of Antioxidant activity research of peptide from Apostichopus Japonnicus Intestinal Tract Tissue ABSTRACT Intestinal tissue was byproducts of processed Apostichopus japonicus, which were selected as materials to determinate the basic nutrition firstly, and then sole factor test and res