姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究..docVIP

姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究 ：王磊柯红王一羽任东明 】目的研究姜黄素对P糖蛋白介导的膀胱肿瘤 多药耐药的逆转作用。方法采用MTT法测定药物的体外杀伤 作用，应用流式细胞术测定细胞内罗丹明浓度。结果姜黄素 不增加阿霉素对BIU-87的细胞毒性作用(P〉)；而对于 BIU-87/ADR,姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P)，逆转 指数为。姜黄素明显抑制p-gp的药物外排作用可能是关键 因素。结论姜黄素通过抑制p-gp的药物外排作用有效逆转 多药耐药。 关键词】姜黄素P糖蛋白阿霉素多药耐药逆转 化疗是膀胱癌术后治疗的重要方法。膀胱肿瘤具有易复 发和产生多药耐药(multidru gresistence,MDR)的生物学特 性，加强膀胱癌MDR逆转研究具有重要意义。就目前研究而 言，MDR的逆转包括以下策略：使用化疗增敏剂、药物化学 修饰、反义技术、载体技术等，对植物药研究较少。本实验 拟观察姜黄素能否逆转多药耐受糖蛋白(P-glyco protEin,P-gp)介导的膀胱癌MDR、逆转效果及其可能机制。 1 材料与方法 材料姜黄素，罗丹明一1 23及MTT均为Sigma公司产品。 盐酸阿霉素为深圳万乐药业公司产品。D MEM培养基为Gibco 公司产品。膀胱移行细胞癌株BIU-87，由北京医科大学泌尿 外科研究所馈赠；耐药株BI U-87/ADR系由本实验室通过采 用递增阿霉素剂量的方式诱导建立的呈典型MDR表型的耐药 细胞亚株。高表达P-gp。细胞在含mg ? L_1浓度的阿霉素、 10%胎牛血清的DMEM培养基中以37°C，5%C02条件培养，实 验前2d换无药培养基培养。 方法 MT T实验将处于对数生长期的两种细胞分别以2X 104/ml浓度接种于96孔培养板，每孔终体积2⑻yl。上述 条件下培养24h,小心吸尽每孔培养液。实验组I分别加入 不同浓度的阿霉素、实验组II分别加入不同浓度的阿霉素加 姜黄素。阿霉素终浓度分别为，，，，5 ( u g/ml),姜黄素终浓 度为25 nmol - L-lo对照组I为不加细胞仅含培养液的空 白对照，对照组II为不加药物仅加细胞的阴性对照，以上述 条件培养48h后，每孔加MTT(5mg/ml)液2 Oul，37°C继续 孵育4h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150U1DMS0, 振荡lOmin使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪 检测49 Onm处的光吸收值(A)。 细胞存活率(10=实验组平均A值/阴性对照组平均A值 逆转指数(RI)=IC5 0(BIU-87/ADR+ADR)/ IC50 (BIU-87/ADR+AD R+CUR) 罗丹明外排实验罗丹明作为P糖蛋白的转运底物能较好 的代表其转运功能［1,2］。将处于指数生长期的BIU-87/ADR 细胞以2X104/ml接种于24孔培养板，每孔终体积lml。上 述条件下培养24h。小心吸弃培养液，加入罗丹明至终浓度 为5ug ?ml-l，上述条件继续培养30mi n，吸弃培养液， 加入不含罗丹明的培养液。实验组I仅含培养液和细胞，实 验组II在I的基础上加入姜黄素至终浓度为25umol -1-1, 对照组为含细胞不加药液组。分别于0，，，h收获细胞。细 胞收获方法为：吸弃培养液、％胰酶消化、冷PBS(0°C)吹洗、 离心(80 0r/min)3次后，500 u 1冷P BS吹散细胞，在流式 细胞仪上检测(激发波长480nm,发射波长540?6 60nm)，以 荧光强度平均值表示细胞内罗丹明浓度。细胞内罗丹明浓度 以下式计算：4=实验组平均荧光强度值-对照组平均荧光强 度值。 统计学处理实验结果取3次实验的均值，标准差均小于 5%,组间显著性差异用t检验。 2结果 MTT试验预试验以姜黄素最高浓度25 umol ? L-1作用 两细胞株48h,细胞存活率均在95%以上，排除了对细胞的 毒性作用。结果表明，姜黄素略增加阿霉素对BIU-87的细 胞毒性作用(P〉)；而对于BIU-87/ADR,姜黄素明显增加阿 霉素细胞毒性(P)，逆转指数为。 表1细胞毒分析1C 50 氺p，氺氺p 细胞内罗丹明浓度图1为不同时间段细胞内罗丹明浓度 的流式细胞仪检测结果。可以看出，在每一时间点，姜黄素 组R-123浓度均显著高于无姜黄素组。姜黄素明显抑制了细 胞内R-123的外排（P图1 R-1 23外排实验 3讨论 尽管生物技术飞速发展，传统医学在世界的许多地方仍 发挥着极其重要的作用。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根 茎中提取的一种酚类色素。姜黄素及其类似物和挥发油是姜 黄主要活性成分，具有抗炎、抗菌、保肝、治疗创伤、抗癌、 抗病毒等活性。其抗肿瘤作用及机制正受到日益重视。 有文献表明，姜黄素对人类恶性肿瘤细胞有诱