蒲公英多糖测定的方法的研究.docVIP

蒲公英多糖测定的方法的研究 　　摘 要：通过对蒲公英脱脂、除单糖和低聚糖、脱蛋白和精制，得蒲公英多糖精制品，再用蒽酮-硫酸法对蒲公英多糖含量进行测定，同时研究其重现性、稳定性及加样回收率。 　　关键词：蒲公英多糖；蒽酮-硫酸法；测定方法 　　糖类是人类能量的重要来源，分为单糖、双糖和多糖。多糖是由十个以上醛糖或酮糖由糖苷键结合起来的糖链。多糖不仅能提供能量，也是组成生物体的重要物质。多糖具有很多生理活性， 　　如：排出毒素、抗衰老、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗辐射等，而且对正常细胞无毒副作用，有很高的研究价值。 　　多糖的检测方法很多，目前尚无国家标准。多糖的测定可分为直接法和间接法。直接法是对多糖本身进行测定，例如：色谱法、光谱法、生物传感器法和酶法等。该法分析数据精确，有效成分明确，但是操作步骤复杂，实验成本高。间接法是利用多糖的还原性，或是利用酚类或胺类化合物与多糖脱水生成的糠醛发生缩合反应产生特定颜色的性质进行测定，例如：硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法和斐林试剂法等。间接法操作简单、快速，不需要昂贵的仪器和特定的酶，因而被广泛使用。 　　蒲公英是《药典》收载的常用中药之一，也是家喻户晓的野生蔬菜，在我国分布非常广泛。蒲公英富含多糖。文章用硫酸-蒽酮法对新鲜采摘的蒲公英多糖进行测定，研究测定结果的重现性、稳定性和回收率的影响，为后续的研究工作奠定基础。 　　一、材料与方法 　　1.材料 　　蒲公英，学院苗圃园新鲜采摘。 　　2.试剂 　　蒽酮试剂：称1 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯，棕色瓶保存。 　　葡萄糖标准溶液：称取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖0.1000 g，用水定容至1000 mL。 　　3.仪器 　　分光光度计、离心机、干燥箱、粉碎机、索氏提取器、旋转蒸发仪。 　　4.方法 　　（1）蒲公英多糖的提取 　　①蒲公英预处理：将新鲜采摘的蒲公英洗净、烘干、粉碎，过100目筛。 　　②脱脂：将蒲公英粉末放入索氏提取器中，用石油醚（沸程40 ℃）回流脱脂3 h。 　　③除单糖和低聚糖：将脱脂蒲公英粉末用80%乙醇回流8 h，除去单糖和低聚糖。 　　④热水浸提：把蒲公英处理物按1∶30的比例放入80 ℃热水中浸提3 h，得蒲公英提取液。共提取2次。 　　⑤浓缩：用旋转蒸发仪对蒲公英提取液进行浓缩。 　　⑥脱蛋白：用Sevag法除去蛋白质。 　　⑦醇析：向浓缩液中加入95%乙醇，使乙醇最终浓度为80%。静置4 h进行醇析，4000 r/min离心5 min。沉淀物即为粗多糖。 　　⑧粗多糖的精制：将粗多糖溶于水，透析36 h，用80%乙醇沉淀多糖，4000 r/min离心5 min。沉淀物再分别用乙醇和丙酮各洗涤3次，干燥得精制多糖。 　　（2）制备蒲公英多糖样液 　　准确称取蒲公英精制多糖粉末0.0100 g，用水定容至1000 mL。 　　（3）蒲公英多糖含量测定 　　①绘制标准曲线 　　取7支25mL比色管，依次加入葡萄糖标准溶液0 mL，0.10 mL，0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，分别加水至2.0 mL，再分别加0.5 mL蒽酮试剂和5 mL浓硫酸，混匀，沸水浴加热5 min，冷却。以0号管为参比管，在620 nm波长下测定吸光值。以葡萄糖的含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 　　②重现性试验 　　准确吸取蒲公英多糖样液2.0 mL于25 mL比色管，按①的方法加入试剂，测定其吸光值。作6个平行样。 　　③稳定性试验 　　准确吸取蒲公英多糖样液2.0 mL于25 mL比色管，按照①的方法加入试剂，分别在显色后10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h， 　　2 h测定其吸光值，从而求出多糖含量。 　　④测定回收率 　　准确吸取蒲公英多糖样液1.0 mL于25 mL比色管，分别加入葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水至2 mL，按照①的方法加入试剂，测定其吸光值。计算加样回收率。 　　二、结果与分析 　　1.绘制标准曲线 　　葡萄糖标准曲线见下图。由下图可以看出，当葡萄糖浓度在0～100 μg/mL时，葡萄糖的含量与吸光度呈良好的线性关系。 　　2.重现性试验 　　根据测得的吸光值，计算得出蒲公英多糖的含量分别为 　　25.68 g/100 g，25.67 g/100 g，24.76 g/100 g，24.65 g/100 g，25.62 g/100 g，24.72 g/100 g，平均值为24.68 g/100 g，RSD=0.20%。实验数据表明该方法的重现性良好。 　　3.稳定性试验 　　在