肝素钠精制工艺的研究.docVIP

肝素钠精制工艺的研究 　　摘要：本实验采用酶解结合氧化法精制肝素，提高了精品肝素钠的效价和色泽。本实验还确定了较优的酶解条件为：酶解时间5h，PH值为8，温度为40℃。在此条件下得到的肝素钠效价为139U/mg。 　　关键词：肝素钠；精制；胰蛋白酶 　　ABSTRACT：The purification procedures of heparin by digestion combined enzymatic oxidation process were investigated，increasing the potency and color of heparin sodium .The experiment was determined the optimum enzymatic hydrolysis conditions by single-factor experiments：5h of the reaction time，8 of the PH value，40℃ of the temperature. Under these conditions，the resulting titer was about 139U/mg. 　　KEY WORDS：heparin sodium；purification；trypsin 　　引言 　　肝素是目前世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗 [1-2]。肝素钠粗品中含有杂质，因此不能直接作为制剂药物的原料，需要先将粗品进行加工纯化得到肝素钠精品。 　　目前，工业上主要是以高锰酸钾或过氧化氢氧化法来精制肝素钠[3]，但是研究表明高锰酸钾氧化法会对肝素钠造成一定程度的破坏，生成的产品会产生活性降低、色泽差等缺点[4]。因此，本实验主要采用酶解结合过氧化氢氧化法来对肝素钠的精制进行研究，并筛选出最佳的实验条件。 　　1实验设备及试剂 　　1.1 实验设备 　　电子天平（YP202N）：上海杰龙仪器有限公司；PHS-3C型数显式酸度计：中国杭州雷磁分析仪器厂；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；高速冷冻离心机；日立工机株式会社；UV752紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；智能恒温恒湿箱：宁波海曙赛福实验仪器厂。智能恒温恒湿箱：宁波海曙赛福实验仪器厂。 　　1.2 实验试剂 　　肝素钠粗品（效价91U/mg）；肝素标准品（效价197U/mg，山东省食品药品检验所）；氯化钠、氢氧化钠、氯化氢（36%）（分析纯，天津惠瑞化工科技有限公司）；过氧化氢（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；天青染料、胰蛋白酶（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）；（巴比妥（分析纯，天津化学试剂三厂）。 　　2实验方法 　　2.1 天青法测定肝素钠效价[5] 　　⑴ 标准曲线的绘制：准确称取肝素钠标准品，配成1U/mL的标准溶液。取1-5mL的标准肝素钠溶液于试管内，加入1mL，pH8.6的巴比妥缓冲液和1mL天青溶液，震荡摇匀，用分光光度计测定505nm光密度值，以效价为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 　　⑵ 样品的测定：精确称取一定量的样品，用蒸馏水配成的含有1mg/l样品的溶液。吸取1-3mL测定液置于大口试管内，加蒸馏水至5mL，再加入1mL，pH为8.6的巴比妥缓冲液和1mL天青溶液，摇匀后，测505nm光密度，按式3-1计算样品的效价。 　　P= （2-1） 　　其中：P=肝素钠样品效价（U/mg）；Pi=测定样品的光密度值在标准曲线上的单位数；W=测定样品总体积（mL）；Vi=测定时所用的样液体积（mL）；Sw=样品称取量（mg） 　　2.2 酶解结合氧化法精制肝素 　　图2-1和2-2分别是酶解直接除蛋白和酶解结合氧化精制肝素的工艺流程。 　　图2-1 胰蛋白酶除杂工艺流程 　　图2-2 酶解结合氧化精制肝素钠工艺流程 　　2.3 酶解法精制肝素钠的影响因素 　　⑴ 时间对酶解法精制肝素钠的影响实验 　　取相同体积pH为8的肝素钠溶液，并加入相同体积浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，在40℃的水浴中，分别加热3、4、5、6和7小时，在加热过程中需不断搅拌。 　　⑵ pH对酶解法精制肝素钠的影响实验 　　取相同体积pH分别为6、7、8、9和10的肝素钠溶液，并加入相同体积浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，在40℃的水浴中加热5小时，在加热过程中需不断搅拌。 　　⑶ 温度对酶解法精制肝素钠的影响实验 　　取相同体积pH为8的肝素钠溶液，并加入相同体积浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，分别在30、35、40、45和50℃的水浴中加热5小时，在加热过程中需不