高产琥珀酸大肠杆菌的代谢工程-生物化工专业论文.docxVIP

摘要中文摘要 摘要 中文摘要 琥珀酸因为其作为大规模化工原料应用的潜力已经引起广泛的关注。而发酵 菌种是由可再生原料生产琥珀酸的关键之一。本文以代谢工程理论为指导，构建 了一系列基因工程大肠杆菌，较系统的研究和改良了大肠杆菌的产琥珀酸特性， 得到的主要结果如下： 大肠杆菌ptsG敲除株TUQ2和野生菌相比生理和发酵特性均发生了很大变 化。具体表现在琥珀酸的产量提高4倍以上，而葡萄糖消耗速率和菌体生长速率 明显趋缓。通过表达半乳糖渗透酶可使a—tJQ2的生长速度加快，并达到比较高的 最后菌浓度，琥珀酸的得率仍旧和rtJQ2保持相同的水平：相反，表达葡萄糖激 酶对TUQ2的生长和代谢产物的分泌都没有很大的影响．进一步在TUQ2中表 达丙酮酸羧化酶能够将琥珀酸的得率提高到更高的1．15 mol／mol葡萄糖，而乙 酸，乙醇和甲酸也均较TuQ2有一定程度的上升。通过半乳糖渗透酶和丙酮酸羧 化酶的共表达，可以将TUQ2葡萄糖的消耗速率从O．33 g，L·h提高到0．6 g／L·h， 同时保持相同的琥珀酸得率。 本文还成功构建了表达假丝酵母甲酸脱氢酶的质粒pQZ8。野生大肠杆菌中 表达甲酸脱氢酶后，菌体对葡萄糖的消耗更快，乙醇的得率提高很多，琥珀酸的 产量变化却很小。在琥珀酸高产菌株TOQ2以及adhE敲除菌TUQ5中表达甲酸 脱氢酶并没有使琥珀酸的产量增加，相反琥珀酸的产量大幅度下降。 通过GAMS软件，以基因组规模的大肠杆菌代谢模型i瓜904 GSM／GPR为 基础，进行琥珀酸得率最大化线性规划。预测琥珀酸的最大理论得率为1．7l moFmol葡萄糖，并找到了一条理论最优产琥珀酸途径。经过TUQ2，W1485／pQZ6 以及TUQ2／pQZ6三株菌的代谢通量分析湿实验结果和理论最优产琥珀酸途径的 比较后，发现了进一步目标改造靶点为羧化途径和乙醛酸循环。其中乙醛酸循环 的通量和琥珀酸的产率有很大的关系。 对乙醛酸靶点进行改造，构建了／c／R系列敲除菌TUQ8和TUQl9。通过对 其发酵和生长的研究得出结论：／c／R基因敲除使菌体厌氧发酵的最终菌体量增大 和乙酸的产率降低。在TUQl9使用pTrc99A-pyc表达丙酮酸羧化酶后乙酸得率 下降到O．2 mol／mol葡萄糖以下，而琥珀酸的得率却上升到了1．29 mol／mol葡萄 糖，明显高于TUQ2／pTrc99A-pyc的1．20 mol／mol葡萄糖的水平。本文还构建了 ldhA、ack-pta、adhE和ptsG之间的组合敲除菌共28株，并对它们的生长和发 酵特性进行了较系统的研究。 关键词： 大肠杆菌琥珀酸代谢工程丙酮酸羧化酶甲酸脱氢酶 乙醛酸循环基因敲除 ABSTRACTABSTRACT ABSTRACT ABSTRACT Succinate had drawn much interest because it’S potential to be used as commodity chemicals．The fermentation strains arc one of the keys to produce succinate from renewable feedstocks．A series of genetic modified Escherichia coli were constructed based on the principles of metabolic engineering．The succinic acid producing capabilities of these mains were studied systematically and the major findings are： Compared with the wild typc,ptsG knock OUt Escherichia coli TUQ2 is different in physiological and fermentation products yields．TUQ2 produced about 4 fold succinate yields，however,it also showed very slow growth and low glucose consumption rates．TUQ2 increased the generation time to approximate 4 h and reached higher final cell density of 2．5啦by expression of galP．However,glk expression had no effect on the mutant．After expression