基因芯片用于鼠疫耶尔森菌检测的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

英文缩写词表 英文缩写词表 ml ml milliliter 毫升 mRNA messenger RNA 信使RNA nt nucleotide 核苷酸 oD optical density 光密度 0RF open reading frame 开放阅读框 PAGE polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺凝胶电泳 electrophoesis PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 pH power ofhydrogen pH值 PMT photomultiplier tube 光电倍增管 PVP polyviaylpyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮 RD restriction display 限制性显示 RNA ribonucleic acid 核糖核酸 RNase ribonuclease RNA酶 rDm revolutions per minute 转／分钟 s second 秒 SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠 SSC standard saline citrate 标准柠檬酸盐 TMED N，N，N’，N-tetramethylethy N，N，N’，N’-四甲基乙二 lenediamine 胺 Tris N．tris(h3，droxymethl)amino— N一三羟甲基氨基甲烷 ethane U Unit 单位 u g microgram 微克 u 1 mieroliter 微升 X．Gal 5-Bromo．4．Chloro．3．Indolyl． 5-溴4-氯一3一吲哚-B j疏 B-D．Galaetoside 代半乳糖苷 Yenterocolhica Yersinia enteroeolitica 小肠结肠炎耶尔森菌 Y pestis Yersinia penis 鼠疫耶尔森菌 Y．pSeUdotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis 假结核耶尔森菌 2 摘 摘 要 鼠疫是由鼠疫耶尔森菌所致的烈性传染病，曾在人类历史上三次大 流行，并造成约2亿人死亡，全世界为之战栗。过去几十年鼠疫在全球 范围内的流行都已经得到有效的控制，但近年陆续又有一些自然疫源地 复燃和新自然疫源地出现，以及可能被生物恐怖分子用作武器，使其仍 然是公众健康安全的隐患。因而我们需用分子生物学手段对该疾病重新 认识，并在快速诊断和疫苗研制上取得了新的突破，才能从根本上遏制 住它的再次大流行，现在利用基因芯片技术对鼠疫菌做进一步的研究仍 具有现实意义。 基因芯片技术是上世纪90年代兴起，源于计算机集成化芯片理念的 一门新技术。实质就是利用Southern blot原理，以可寻址的方式在载 体表面，有序地点阵排列大量DNA双链或Oligo探针。这些被固定在基质 的探针上就形成了高密度DNA微阵列。样品DNA或RNA经过荧光标记，与 阵列上的探针进行杂交反应，按照碱基互补配对原则，探针特异性地结 合相应被荧光标记的分子。用激光激发荧光标记物，就可获得样品分子 的信息，从而对基因序列及功能进行大规模、高通量、平行地研究。 鼠疫耶尔森菌含有3个公认与致病性有关的质粒，分别是9．5kb、 70kb和llOkb，已知的序列提示它们的开放阅读框编码密度很高在70％ 以上，并且集中了多数已知的鼠疫致病性基因，我们直接利用其限制性 片段，采用我们建立的巢式PCR方法进行扩增，制备出供芯片打印的探 针，并结合马文丽、郑文岭等建立的限制性显示(Restriction Display， 简称为RD)技术标记样品用于鼠疫的检测。 通过我们对芯片的杂交条件改进，取消标记样品的纯化过程，提高 杂交温度从42。C至52c年u在低严谨洗脱之前先使用蒸馏水冲洗，可有 效提高DNA芯片的杂交阳性信号，降低背景和非特异性干扰。提高了检 测芯片的信噪比，使其特异性显著提高，获得可信的杂交结果。基因芯 片结合RD技术，既快速又能在标记过程中实现样品扩增，发挥基因芯 片高度灵敏、准确和简便快速的优点。同时平行检测多个基因，这对鼠 疫这种烈性传染病的诊断提供新的科学方法。 进行Blast分析，确定出鼠疫菌最为特异的序列，用以设计成60mers 进行Blast分析，确定出鼠疫菌最为特异的序列，用以设计成60mers 的寡核苷酸探针。固定探针在用多聚一L一赖氨酸处理过的玻片上，制备 成寡核苷酸基因芯片，同样采用RD技术进行样品标记，用以检测。通 过我们对杂交条件的改进，能更好的降低非特异性杂交，结果显示，该 芯片具有很好的特异性。 同时，我们将Oligo芯片用于比较鼠疫活疫苗菌株EV和分离自我国 云南的野生株之间已知毒性基因的表达差异，采用随机引物标记方法，