PCR技术--基因扩增技术.ppt

第五节 基因扩增技术 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。 PCR技术：1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。 Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。 二、PCR技术的原理 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。95℃ 2. 退火 (复性) (Annealling): 降低反应体系的温度使寡核苷酸引物与DNA模板互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。55 ℃ 也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。 3. 延伸 (Extension): 升高反应体系温度至72 ℃ ，以4种dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下，从引物的3′-OH 端延伸，以变性后的单链DNA为模板，合成出5′→ 3′的互补链。 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-55?C 双链DNA分子 双链断开 循环1 模板与引物结合 循环1 循环1 Taq Taq 循环1 双链断开 循环2 模板与引物结合 循环2 循环2 PCR循环次数与DNA产量关系 理论上，终产物DNA的量可用Yn=X．2n计算 但在实际扩增过程中，扩增效率不可能达到100% Yn=X．（1+E）n 0≤E≤1 四、PCR的反应体系 1.模板DNA： 被复制的核酸片段，在用RNA作模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。 2.引物： 为化学合成的寡核苷酸，每条被扩增的模板有两条引物，其决定着PCR扩增产物的特异性和长度。 3.脱氧核苷三磷酸（ dNTP）： dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP 浓度为0.02 ～ 0.2 mmol/L 4. Taq DNA 聚合酶： 催化DNA的合成 0.5 ～ 5 U / 100 μl，偏高：引物非特异产物的扩增；偏低：产物量降低 5. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mmol/L Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量 过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 6. 缓冲液： 10 ～ 50 mmol/L Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mmol/L KCl 促进引物退火，50 mmol/L 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。 五、注意事项 1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室 保护操作人员 保护环境 保护样品