副猪嗜血杆菌ompp5cdtabc免疫原性分析和间接elisa检测方法的建立预防兽医学专业论文.docxVIP

副猪嗜血杆菌ompP5、cdtABC基因原核表达及免疫原性分析和间接ELISA检测方法的建立与应用 副猪嗜血杆菌ompP5、cdtABC基因原核表达及免疫原性分析和间接ELISA检测方法的建立与应用 ：摘 要 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)属于革兰氏阴性菌，来自于巴斯德 茵科的嗜血菌属，是革拉瑟氏病(Ghsser)的病原体，长期栖息在猪群上呼吸道，在 机体免疫力低下时侵入机体引发严重的全身性疾病，典型临床病变特征表现为以纤 维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等，威胁当前养猪业最重要细菌性病原之一， 给当前养殖业造成巨大经济损失。目前预防该病注射的疫苗为主要以高毒力血清型 4型和5型菌株作为灭活苗，由于副猪嗜血杆菌血清型众多，菌株问毒力差异也较 大，目前灭活苗能不同时对所有致病菌产生交叉保护。随着对副猪嗜血杆菌高毒力 菌株全基因组测序的完成，可以利用分子生物学手段进行基因工程疫苗的研究。本 研究基于本实验室对5型高毒力副猪嗜血杆菌SH0165菌株测序完成及后续研究发 现18个在HPS流行菌株为保守基因或操纵子基因，选择了ompP5、cdtABC基因进 行克隆表达，并将三个蛋白分别免疫Balb／C小鼠研究其免疫原性。 主要研究内容如下： 1．副猪嗜血杆菌ompP$、cdtABC基因的克隆表达及免疫原性分析 根据G蛆Bank中的副猪嗜血杆菌序列设计引物，分别扩增ompP5、cdtA、cdtB 和cdtC基因，然后将四个基因分别克隆到表达载体pET-2$a(+)和pGEX-KG上，将 重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，经诱导表达和纯化后得到四种重组蛋白。将四 种重组蛋白进行乳化，免疫Balb／C小鼠，初次免疫弗氏完全佐剂，二次免疫弗氏不 完全佐剂，二免两周后用5xLD50的副猪嗜血杆菌SH0165攻毒。并设立分组如下： 试验组一(灭活全菌)、试验组二(ompPS)、试验组三(cdtA)、试验组四(cdtB)、 试验组五(cdtC)、试验组六(ompPS+cdtA+cdtB+cdtC)和PBS对照组。通过监测 抗体发现，cdtA和cdtC的免疫原性高于cdtB组，但低于全菌免疫组。而在免疫后 的攻毒保护力实验中，cdtB重组蛋白免疫组保护率为60％高于cdtA(40％)和cdtC (40％)蛋白免疫组，与灭活全菌免疫组保护率(60％)相同。ompP5蛋白的免疫 原性和攻毒保护力(40％)均低于灭活全菌免疫。结果显示四种重组蛋白都有一定 的免疫原性，其中cdtB能提供与灭活全菌免疫相同的保护力。 2．副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法的建立及应用 利用四种重组蛋白作为包被抗原确定最佳包被浓度和血清稀释浓度，并优化其 他相关反应条件，建立了重组蛋白包被的间接ELISA检测方法，并建立了灭活全菌 华中农业大学201 华中农业大学201 l届硕士学位论文 包被抗原间接ELISA方法和超声破碎抗原间接ELISA作为对照。临床检测中与灭活 全菌包被间接ELISA检测方法符合率为81．7％，无显著性差异(PO．05)；与超声 破碎抗原包被间接ELISA检测方法符合率为78．7％，有显著性差异(PO．05)。但 三种方法监测阳性率趋势相同，故四种重组蛋白抗原包被的间接ELISA检测方法可 行。， 关键词：副猪嗜血杆菌ompP5 cdtABC免疫原性间接ELISA 2 副猪嗜血杆菌ompP5、cdtABC基因原核表达及免疫原性分析和间接ELISA检测方法的建立与应用AB 副猪嗜血杆菌ompP5、cdtABC基因原核表达及免疫原性分析和间接ELISA检测方法的建立与应用 AB STRACT Haemophilus parasuis is a Gram-negative ba倒um belonging to the P翻武峨Uaceae family,which is the pathogen of the Glassers disease．It colones in the porcine upper respiratory tract and can c纠呱蛤all body organism infection with immunity of the bodys decreased,which can be characterized as fibrinous polyerositis，meningitis and arthritis in veterinary clinics．Currently,it is increasing economic losses in the swine industry worldwide．Control of H．parasuis infections oan be ac