番茄acc合酶的催化机制及其c端水解蛋白酶的相关研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

番茄ACC合酶的催化机制及其C端水解蛋白酶的相关研究 番茄ACC合酶的催化机制及其C端水解蛋白酶 的相关研究 博士生：李剑峰 导师：屈良鹄教授 专业：生物化学与分子生物学 摘 要 植物激素乙烯参与了植物生长发育等一系列重要的生理过程，通过控制乙烯的 合成进而控制经济作物的衰老和果实的成熟将给农业生产带来深远影响。ACC合酶 (1-aminocyclopropane．1一carboxylate synthase)是控制高等植物乙烯生物合成的关键 限速酶。最近，关于番茄ACC合酶一辅酶PLP一抑制剂AVG复合物的x一晶体衍射 结构分析表明番茄ACC合酶(LeACS2)的Tyrl52残基距离底物类似物AVG的y 碳原子仅3．5A，暗示了该残基可能与底物SAM向ACC转变过程中C-丫．S键的断裂 有关。在本研究中，我们发现Tyrl51和Tyrl52在高等植物ACC合酶多基因家族中 均保守且均定位于计算机模拟的ACC合酶催化活性中心附近。通过在LeACS2上 分别引入Y151F、Y151G、Y152F、Y152G和Y15IFYl52F点突变，我们发现Y151F 和Y15IG突变分别保留73％和17％的酶活，这暗示了Tyrl5l有可能参与了催化活 性中心的形成；同时，所有Tvrt52的突变，包括Y152F保守突变都几乎使酶完全 失活，这表明Tyrl52．尤其是其上的羟基基团，对底物SAM的结合与转变至关重 要。在原有的ACC合酶催化机制之上，我们提出一种更为合理的Tyrrl52残基介导 的催化机制。在这种机制中，正是Tyrl52上的羟基对SAM的Y碳原子实旌亲核攻 的催化机制。在这种机制中，正是Tyrl52上的羟基对SAM的Y碳原子实旌亲核攻 击才促使其发生a，Y消减反应进而生成ACC。 目前，ACC合酶潜在的翻译后蛋白酶加工机制仍未被阐明，原因之一就是因为 迄今为止植物中没有任何能够水解ACC合酶的蛋白酶被分离纯化和鉴定。在本研 究中，我们通过SDS煮沸一免疫印迹法检测到番茄体内ACC合酶(LeACS2)的蛋 白酶水解，同时发现在体外LeACS2也能被番茄果实蛋白酶粗提物水解。为了从该 粗提物中纯化水解LeACS2的蛋白酶，我们建立了一种以重组表达的LeACS2．GST 融合蛋白为底物的体外蛋白酶活性检测方法，并经过DEAE阴离子交换、凝胶过滤 和MonoQ阴离子交换三步色谱纯化，最终分离到一种约64kDa且与LeACS2体外 水解相关的蛋白酶。经ESI质谱分析和生化鉴定，该蛋白酶属于金属蛋白酶M41 家族．在pH8．0和37℃具有最高的水解效率，且其蛋白酶活性能被金属蛋白酶抑制 剂l，10、phenanthroline彻底抑制。蛋白质N端测序和MALD[．TOF质谱分析表明此 蛋白酶不水解LeACS2的N末端而是特异性的在其c末端的Ly’s438至Leu474区域 内进行多处水解。水解产生的截短LeACS2其ACC合酶活性并未发生显著改变。 因为该蛋白酶在体外水解LeACS2的方式和体内检测到的LeACS2水解方式相一致， 我们推测该蛋白酶很可能是体内对LeACS2进行翻译后加工的蛋白酶。相应的，该 蛋白酶在体内对LeACS2的加工很可能使后者失去Ser460磷酸化位点而逃避了去磷 酸化及ETO一1蛋白介导的蛋白酶体降解，成为有活性且更稳定的截短LeACS2。 最后，根据该番茄蛋白酶的蛋白质N端测序结果，通过设计简并引物进行 RT-PCR、DNA测序和序列的生物信息学分析，我们筛选出该蛋白酶基因的候选序 列，随后通过5’RACE获知其全长基因并确定了该基因在番茄基因组上的基因结构。 我们对5’端缺失的蛋白酶基因进行克隆并于大肠杆菌中表达，表达产物经过GST 亲和纯化和凝血酶水解除去GST肽段后在贮存过程中经自身水解激活并能使 LeACS2发生相同的水解，至此汪明我们克隆到的是正确的基因。该蛋白酶基因的 解码为体内ACC合酶翻译后蛋白酶加工机制的深入研究奠定了基础。 关键词：番茄；ACC合酶：定点突变：金属蛋白酶；纯化。 II Study Study on the Catalytic Mechanism of ACC Synthase and Identification of an ACC Synthase C-terminus processing Protease in Tomato PhD candidate：Jianfeng Li Supervisor：Lianghu Qu Major：B iochemistry and Molecular B iology Abstract The simplest phytohormone ethylene has profound and diverse effects in t