zmobilis木糖代谢通量分析及关键酶基因的改造生物化工专业论文.docxVIP

摘要运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌，微好氧生长。Z．mobilis是目前发现的乙 摘要 运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌，微好氧生长。Z．mobilis是目前发现的乙 醇发酵能力最强的微生物之一，被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种。 Z．mobilis可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖。利用基因工程手段改造 Z．mobilis，拓宽其可利用碳源的范围，使其能利用五碳糖发酵产醇是当前运动发 酵单胞菌基因工程改造工作的首要任务之一。 本研究对已有的Z．mobilis重组工程菌株进行了代谢通量分析。结果表明Ⅺ、 和TAL是主要的限速酶；为提高Ⅺ的酶活水平，对Z．mobilis基因表达与调控 机制进行分析，通过改变相关基因终止密码子之后的序列结构，提高相关基因的 表达水平。为此构建了pBSKS—Pgap-xx-L和pBSKS—Pgap-xx-S，即以E．coli染色 体为模板PCR扩增片段三(xylB基因下游的一段序列，含一个转录终止子)，S (xylB基因下游的一段序列，不含转录终止子)，通过酶切位点HindlII和EcoT22I 与质粒pBSKS-Pgap—XX连接；进而构建了穿梭质粒pZA22一Pgap-xylAB-L和 pZA22．Pgap-x-ylAB．S，电转进Z．mobilis CP4菌株中。 对基因工程菌株的XI、XK酶活测定结果表明，CP4(pZA22．Pgap-xylAB-L)XI 酶活为0．195U／min／mg蛋白；XK酶活为2。159 U／min／mg蛋白，分别比出发工程 菌CP4(pZA22一Pgap-xylAB-O)提高6倍和3．8倍：cP4(pZm2一Pg印-xylAB-S)XI 酶活为0．0735U／min／mg蛋白；XK酶活为O．810 U／min／mg蛋白，分别比出发工 程菌CP4(pZA22．Pgap-xylAB-O)提高2．3倍和1．4倍。和Z．mobilis菌株CP4相反， 在DH5 a中，DH5 Q(pZA22一Pgap-xylAB-L)的酶活水平比DH5 (pZA22．Pgap-xylAB．S1低，X1分别为0．022 U／min／mg蛋白，0．098 U／min／mg蛋白； XK分别为0．117 U／min／mg蛋白0．642 U／min／mg蛋白。 结果表明终止密码子之后的序列结构对基因表达水平效果明显，但在E．coli 和Z．mobilis中的作用机理不同。 关键词：运动发酵单胞菌代谢通量分析木糖异构酶酶活测定 ABSTRACTZymomonas ABSTRACT Zymomonas mobilis is an anaerobic，gram—negative bacterium producing ethanol via Entner-Doudoroff pathway and be known舔an efficient ethanol producer． However,its substrate spectrum is narrow,since it uses only sucrose，glucose and fructose as carbon sources．Numerous efforts have been unclertaken to broadcn its substrate range。 BaSed on the xylose metabolic flux analysis of a recombinant Zymomonas mobilis strain，CP4(pZA22-Pgap-xylAB-O)，it is indicated that xylose isomerase(XI)and transaldolase(TAL)ale rate—limiting enzymes in the recombinant one． To enhance the expression of XI，two plasmids，pZA22一Pgap-xylAB-L and pZA22·-Pgap-xylAB··S with different sequence structure after termination codon were costructed and transformed into Zymomonas mobilis CP4 and E．coli DH5Ⅱ． The enzyme activity of XI in Z．mobolis transformants，CP4(pZA22一Pgap-xylAB一∽， CP4(pZA22一Pgap-xylAB一研and CP4(pZA22-Pgap-xylAB-L)is 0．033，0．0735 and 0．1