胞内共生菌wolbachia用于水稻虫媒病毒病害防治策略及其相关基因的研究遗传学专业论文.docxVIP

望堕苎竺堕丝!丝丝塑旦王查塑皇堡堑耋塑童堕垂!!竖壁基塑薹董旦苎!!塑摘 望堕苎竺堕丝!丝丝塑旦王查塑皇堡堑耋塑童堕垂!!竖壁基塑薹董旦苎!!塑 摘 要 灰飞虱(三口oeelphax striatellus)是我国主要的水稻害虫，通过传播水稻条纹 叶枯病毒(Rjce Stripe Virus，Rsv)造成大面积的水稻减产。除了少数内陆省份外， 我国大多数地区的灰飞虱体内感染有Wolbachia，Wolbachia是一种广泛存在于各 种节肢动物体内经母系细胞质遗传的胞内共生菌。它能够改变宿主的生殖和发育 行为，引起细胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility,CI)，孤雌生殖，雌性化和 雄性致死等现象，从而使感染有Wolbachia的宿主在整个种群中具有生殖优势。 本文以媒介昆虫一共生菌技术(Vector—Insect—Symbiom Technology，VIST)为立论 基础，围绕Wolbachia是否在灰飞虱体内存在广泛的分布，Wolbachia与RSV在 灰飞虱体内的分布是否存在重叠，果蝇特异的Wolbachia是否能够超感染灰飞虱， 超感染灰飞虱是否能够稳定传代，是否在整个种群中具有生殖优势展开，为VIST 应用于虫媒病毒病害的野外控制提供了系统、坚实的理论和实验基础，同时进行 了Wolbachia相关基因的研究。 ／本文深入研究了自然界已感染了Wolbachia的灰飞虱体内Wolbachia的分布 状况，PCR和Western Blot的检测结果显示Wolbachia广泛存在于灰飞虱体内的 生殖组织和头、胸、腹、唾液腺、消化道等非生殖组织中。荧光免疫组织化学检 测显示：Wolbachia呈簇状，不均匀地分布在灰飞虱的不同组织内，结合golbachia 在灰飞虱卵内的分布，表明Wolbachia在宿主体内的分布是在发育早期就已经被 决定了的；Wolbachia在灰飞虱未成熟卵间的不均匀分布表明其经卵垂直传递并 非100％：Wolbachia与RSV在灰飞虱卵内的分布存在重叠。上述结果显示 Wolbachia是在灰飞虱体内实施VIST策略的理想载体。 进而，本文采用显微注射灰飞虱雌虫腹部侧面的方法首次成功地将果蝇 fDrosophila simulans)特异的、具强烈cI表型的肋f6achia超感染灰飞虱，经巢 式PCR检测和逐代单管单对筛选，超感染灰飞虱已稳定传代至第12代，超感染 率稳定在30％左右。cI检测表明超感染的灰飞虱相对于单感染灰飞虱表现为单向 不亲和，从而在这一领域最先实现了在亲源关系很远的宿主之间建立Wolbachia 超感染的水平转移路径。超感染灰飞虱的后代个体间存在两种Wolbachia分离的 现象，统计结果表明获得一个高感染率的超感染灰飞虱单雌系将是一个漫长的过 程。上述结果显示了利用Wolbachia在已感染Wolbachia的昆虫种群中通过超感 染传播目的基因，进行种群取代的可能性，验证了应用VIST策略进行水稻虫媒 病毒病害防治的可行性。 为了探索Wolbachia导致宿主生殖异常的分子机理，本文采用RDA (Represemational Difference Analysis)和LM—PCR(Ligation-mediated PCR)的方法 绕过了Wolbachia不能进行人工离体培养这一难点，研究了具有不同cI表型的 胞内共生苗Wolbachia用于水稻虫媒病毒病害防治馨堕垦基塑羞茎堕塑堑篓Wolb口幽胁之间的差异，克隆了下列Wolbachia相关基因：噬菌体相关尾蛋白基 胞内共生苗Wolbachia用于水稻虫媒病毒病害防治馨堕垦基塑羞茎堕塑堑篓 Wolb口幽胁之间的差异，克隆了下列Wolbachia相关基因：噬菌体相关尾蛋白基 因prtp(phage—related tail protein)(AY043263，AF420275)：谷胱甘肽调控的钾离子 外流通道蛋白基因kefkl(glutathione—regulated potassium—efflux system protein) (AY040670，AF420276)。 通过研究prtp在不同Wolbachia品系间的表达，发现PrTP可能不直接参与 cI现象。prtp基因的存在为噬菌体介导的基因水平转移(horizomal gene transfer， HGT)提供了直接证据，体外果蝇s2细胞的瞬时转染实验结果证明了prtp基因 内双向核定位序列(bipartite nuclear localization signal sequence， NLS)的功能， 并提示其在Wolbachia的生殖特性中可能扮演重要的角色。 基因序列分析表明缸御编码的氨基酸序列包含两个重要的，保守性较高