人类线粒体基因组cpg甲基化模式法医学专业论文.docxVIP

河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应法律责任。 暨谣}-?；疆蠡艇。蝴 研究生签名：烈亟话导师签章：疋爿峨li二级学院领导盖章誉蠢一誉爹 沏『5年)月：ID日 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生签名：烈宝静 聊氍啾 如焐年5月jo日 万方数据 目 目 录 中文摘要 1 英文摘要 5 英文缩写 ．．． ．．10 研究论文人类线粒体基因组CpG甲基化模式 前言日¨舌 11l 材料与方法 ．．12 结果 ．．17 附图 ．．20 附表 ．．28 讨论 ．．42 结论 ．．44 参考文献 ．．45 综述线粒体DNA甲基化研究进展 ． 48 致谢 ．．58 个人简历 ．． 59 万方数据 中文摘要人类线粒体基因组CpG甲基化模式 中文摘要 人类线粒体基因组CpG甲基化模式 摘 要 目的：我们在最近的一项国家自然科学基金项目(DNA甲基化在鉴 别同卵双生个体中的研究，No的研究中，发现人类血液样本 线粒体DNA控制区的一段序列甲基化水平为2％--．，34％，并在同卵双生子 (monozygofic twins，MZT)之间存在较大差异，可以鉴别多达31．93％的 MZT，且具有明显的组织差异性，其在唾液样本中得甲基化程度几近于0。 这些结果引发了我们对于mtDNA甲基化这一研究领域的关注和思考。追 踪有关mtDNA甲基化研究的文献，发现该领域的研究较少，并且存在争 议。最早关于mtDNA甲基化的研究报道出现在30年前，Dawid对青蛙 和Hela细胞的研究表明，二者均不存在mtDNA甲基化。之后有研究发 现在小鼠、仓鼠、人类等种属，应用甲基化敏感性限籼性内切酶分析均检 测到低水平的mtDNA甲基化。近来有研究报道mtDNA甲基化与多种疾 病相关，但也有报道认为mtDNA几乎没有甲基化。这些存在矛盾的结果 可能与mtDNA甲基化检测的方法不同有关。亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序 技术是目前公认的检测DNA甲基化的金标准，能够对每一个CpG位点进 行精确定量，并通过内质控监测亚硫酸氢盐转化率而具有较高的准确性。 综上，本研究拟应用亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序技术对线粒体甲基化 进行进一步研究，将检测覆盖mtDNA控制区、13个蛋白质基因、2个rRNA 基因及22个tRNA基因的CpG位点的甲基化情况，建立人类线粒体基因组 DNA甲基化精确定量检测方法，绘制一张较完整的人类线粒体基因组甲 基化图谱，为m1DNA甲基化遗传标记的法医学应用及栋床应用研究奠定 基础。 方法：按照知情同意原则，采集健康个体外周血样本154例，收集漱 口水样本24例，每位受试者均签署知情同意书。对线粒体基因组CpG位 点进行生物信息学分析，发现共有435个CpG位点且分布不均匀，其中 轻链复制起始点(0L)(5721,--,5798bp)处分布密度最高，tRNA基因分 布密度最低。根据上述生物信息学分析结果，应用Ass!ty Design引物设计 软件分区段设计扩增引物和测序引物，本研究共设计20对扩增引物及相 万方数据 中文摘要应的20条测序引物，可检测20条序列共83个CpG位点甲基化程度。20 中文摘要 应的20条测序引物，可检测20条序列共83个CpG位点甲基化程度。20 条序列依次命名为MTl～MT20。提取血液样本及漱口水样本的全基因组 DNA，用Bam H I处理DNA将mtDNA的环状结构打开，进行亚硫酸氢 盐转化。已转化的DNA为模板，PCR扩增20条特异性mtDNA序列，对 扩增产物进行焦磷酸测序，获得各CpG位点的甲基化定量值。本实验通 过MTl、MT2、MT3、MT4四条序列的分析比较开环组与未开环组检测 情况的差异。应用SPSSl3．0软件进行统计分析，分析方法有：配对t检 验、方差分析、秩和检验等方法进行统计学分析。 结果： l线粒体DNA环状结构对亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序的影响 1．1．1线粒体DNA环状结构对焦磷酸测序通过率的影响 通过对65～154个血液样本的检测，我们发现4条序列MTl、MT2、 MT3、MT4在开环组的焦磷酸测序通过率分别为78