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睾酮在巨噬细胞及其杜氏利什曼原虫感染中的作用机制生物化学与分子生物学专业论文
上海交通大学学位论文版权使用授权书
上海交通大学
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日期:1卿1年1月~1 Et 日期:枷6年(月叫Et
上海交通大学博士学位论文睾酮在巨噬细胞及其杜氏利什曼原虫感染中的作用机制
上海交通大学博士学位论文
睾酮在巨噬细胞及其杜氏利什曼原虫感染中的作用机制
摘要
雄激素可以促进多种疾病的发生发展,大量临床及流行病学资料显 示,男性比女性更易感染细菌、病毒、寄生虫等病原微生物,其具体机 制不详,可能与雄激素抑制机体免疫有关。黑热病是由杜氏利什曼原虫 引起的一种致死性寄生虫病,杜氏利什曼原虫寄生于宿主的巨噬细胞中, 从而引起一系列的单核巨噬细胞系统的病变。阐明雄激素在黑热病中的 作用机制将为疾病的预防和治疗起重要的指导作用,我们在体外分离培 养杜氏利什曼原虫和骨髓巨噬细胞,试图从分子水平探索雄激素对杜氏 利什曼原虫细胞内感染的调控机理。
本实验使用L929细胞条件培养基作为巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage.cloning stimulatory factor,M—CSF)来源,诱导小鼠骨髓细胞 向巨噬细胞分化。原代培养5天后,利用荧光标记的巨噬细胞特异性
F4/80抗体,通过流式细胞仪对培养体系中巨噬细胞的纯度进行分析, 同时分选出F4/80抗原呈阳性表达的细胞,此即为骨髓来源的巨噬细胞 (bone marrow-derived macrophages,BMMs)。首先用Annexin V-FITC/PI
双染法观察不同处理时间睾酮对巨噬细胞活性的影响。然后提取巨噬细
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虫感染组巨噬细胞中ERKl/2、p38MAPK和JNK/SAPK基因的激活状 况,并用特异性MAPK(有丝分裂原激活蛋白激酶)抑制剂进一步检测 MAPK信号途径在杜氏利什曼原虫感染巨噬细胞中的可能作用。为探讨 雄激素在巨噬细胞中的作用机制,采用RT-PCR、Western blotting、FCM
和CLSM等方法检测巨噬细胞中是否有雄激素受体的表达,同时观察不 能自由透过细胞膜的testosterone.BSA(,BBSA)分子在巨噬细胞膜表面 的结合状况,最后测定巨噬细胞中游离钙离子浓度。
实验发现,雄激素可以诱导骨髓巨噬细胞凋亡,并伴有Fas,FasL 和Caspase.8凋亡相关基因的表达增加,我们推测雄激素是通过Fas/FasL 途径诱导骨髓巨噬细胞凋亡的。而感染了杜氏利什曼原虫后的细胞凋亡 数则明显减少,凋亡在寄生虫和宿主相互作用中具有重要意义,寄生虫 会因抑制宿主细胞发生凋亡而达到维持感染和虫荷的目的。
性激素对靶细胞的作用可以通过两种不同途径来实现:一种是经典 途径即基因组途径,性激素通过自由扩散进入胞浆并与相应受体结合, 活化的受体二聚体与HRE特异结合,启动下游相关基因转录;另一种途 径是近几年来逐渐引起人们关注的非基因组效应,其特点是作用快,不 需进入细胞即可起效,随后也可由于细胞的内吞作用而进入胞内。本研 究采用多种方法试图在巨噬细胞中寻找雄激素的受体,包括RT-PCR、 Western。blotting、FCM以及CI_sM等,然而,这些方法都不能提供有说
服力的证据说明巨噬细胞中存在雄激素的细胞内受体,很显然,雄激素
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在巨噬细胞中的作用机理不能够用传统的激素一细胞内受体模式来解释。 相反,使用不能通过细胞膜的雄激素.BSA,我们发现巨噬细胞的表面存 在有睾酮的结合位点,并且激素结合以后能迅速引起巨噬细胞内游离钙 离子浓度增加,细胞内钙离子的增加主要是由细胞外钙离子内流而不是 细胞内钙离子释放引起的。
我们发现雄激素可以增加杜氏利什曼原虫对巨噬细胞的感染率与感 染水平。寄生虫对宿主细胞正常信号传导途径的干扰是其在胞内生存的 必要条件,蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息 传导调节方式,几乎涉及所有的生理及病理过程。MAPK是细胞内的一 类丝氨酸/苏
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