京尼平对去细胞化猪肝脏组织材料免疫原性影响的研究-外科学专业论文.docxVIP

目 目 录 l 京尼平对去细胞化猪肝脏组织免疫原性影响的研究 l 1．1中文摘要 1 1．2英文摘要 4 1．4材料与方法 10 1．5结果 18 1．6讨论 32 1．7结论 38 1．8参考文献 39 1．9英汉缩略词对照表 47 2 致谢 48 3 京尼平对去细胞化生物支架材料修饰的研究进展(综述) 49 万方数据 四川医科大学硕士学位论文京尼平对去细胞化猪肝脏组织材料免疫原性影响的研究 四川医科大学硕士学位论文 京尼平对去细胞化猪肝脏组织材料免疫原性影响的研究 摘 要 煳必掣 目的：制备具有低免疫原性的去细胞化猪肝脏组织材料，探讨经 交联剂京尼平修饰的去细胞化猪肝脏组织材料的免疫原性，为进一步 利用去细胞化肝脏生物支架材料重建肝脏器官并实现临床异体移植 奠定实验基础。方法：①去细胞化猪肝脏组织材料的制备及其修饰： 1)．随机选取体重为12—15kg雄性巴马小型猪4只，将其深度麻醉， 取其完整肝脏，并随机选取其中3个肝脏，经门静脉插管后，以 1％SDS+1％Triton X．100方案灌注对完整猪肝脏进行去细胞化处理， 制成去细胞化的猪肝脏生物组织材料；另一只未经去细胞化的猪肝脏 作为对照组。对去细胞组及未去细胞组材料进行病理切片并用苏木精 和伊红染色(HE)，Masson’S trichrome染色，免疫组织化学染色， DNA含量分析及PCR检测抗原基因表达以评价去细胞化效果。2)．将 去细胞化的猪肝脏组织材料切成直径约为1．5cm的方形块，并将其随 机分为三组(每组约30块)，其中两组分别给予浓度为O．625％的京 尼平(GP)和浓度为的0．625％戊二醛(GA)进行交联，另一只未去细胞 肝脏亦切成相同大小方形块，作为对照组。然后对各组材料(GP修 饰去细胞组，GA修饰去细胞组，未修饰去细胞组及未去细胞组)进 行形态学观察，病理切片HE染色检测其显微结构及细胞成分清除 情况，并且通过电子显微镜观察各组细胞外基质三维立体结构。②去 细胞化及去细胞化后修饰的肝脏组织材料体外诱导单核细胞迁移及 万方数据 四川医科大学硕士学位论文异体植入大鼠皮下局部反应实验：1)．以U．937人单核细胞系进行体 四川医科大学硕士学位论文 异体植入大鼠皮下局部反应实验：1)．以U．937人单核细胞系进行体 外迁移实验，运用碾磨器碾磨材料并高速离心方法分别提取GP修饰 去细胞组，GA修饰去细胞组，未修饰去细胞组及未去细胞组的猪肝 脏组织材料中的蛋白，利用带有PET膜的六孔板行体外迁移试验检 测人单核细胞分别对各组蛋白提取物的迁移反应。2)．将各组已经切 好的等体积小块组织材料分别植入SD大鼠皮下，并分别于植入后第 3，7，14及28天取出植入的材料及其周围包裹组织，进行病理切片及 HE染色，并在高倍视野下对材料周围浸润的粒细胞／淋巴细胞及单 核巨噬细胞分别进行记数，检测材料组织在动物体内的免疫排斥反 应。结果：①去细胞化及交联修饰后的检测：1)．HE及Masson’S trichrome染色显示去细胞化的肝脏组织材料中细胞成分被清除干净， 并保留了原组织的细胞外基质三维立体结构，该三维立体结构成分包 括胶原蛋白、弹性蛋白和硫酸粘多糖(GAGs)等成分；琼脂糖凝胶电 泳显示去细胞化后的肝脏组织材料中未观察到DNA残留片段，PCR 表明组织中的01．1，3半乳糖．p．1，4半乳糖．N．乙酰氨基葡萄糖抗原、猪 白细胞抗原(SLA)、猪内源性逆转录病毒(PERV)等与免疫反应有 关的成分均被清除；免疫组化提示细胞外基质特定位置的gal抗原表 位明显减少。2)．经京尼平和戊二醛交联后的去细胞化肝脏组织材 料外观分别表现为深蓝色和褐色，体积较前有所变小，质地变硬。经 修饰后材料的HE染色显示去细胞化肝脏组织材料仍未见细胞成分 残留，并且未改变其细胞外基质的三维立体支架结构；扫描电镜 (SEM)观察到去细胞化的肝脏组织材料表现出较未去细胞化的肝脏 万方数据 四川医科大学硕士学位论文组织材料更丰富的相互交联的多孔结构，经京尼平及戊二醛交联并不 四川医科大学硕士学位论文 组织材料更丰富的相互交联的多孔结构，经京尼平及戊二醛交联并不 会影响其多孔性。②免疫原性检测：1)．体外人单核细胞迁移实现表 明GP修饰去细胞组，GA修饰去细胞组，未修饰去细胞组及未去细 胞组的猪肝脏组织材料提取蛋白分别作为迁移实验底物时，分别有 (34．67+4．33)×103，(31．67+2．906)x103，(64．33+6．936)×103， f108．8士15．33)×103个U．937细胞自由迁移到下腔室，对比未去细胞的 肝脏组织提取蛋白，去细胞后的肝脏组织材料提取物能明显的降低人 单核细胞迁移率(P0．05)，且经交联剂修饰后能进一步降低迁移率 (PO．05)。2)．将