建立帕金森病细胞模型筛选具有神经元保护活性的小分子化合物-制药工程专业论文.docx

建立帕金森病细胞模型筛选具有神经元保护活性的小分子化合物 建立帕金森病细胞模型筛选具有神经元保护活性的小分子化合物 万方数据 万方数据 建立帕金森病细胞模型筛选具有神经元保护活性的小分子 摘要 目的：LUHMES 细胞可以被分化成为有丝分裂后细胞，并且在生化性质、细 胞形态和功能等各方面都与多巴胺能神经元相类似。为了发现在治疗帕金森病方 面具有神经元保护作用的化合物，我们建立了以分化后 LUHMES 细胞为基础， 模拟多巴胺能神经元退行性变的模型。 方法：LUHMES 细胞在 cAMP 和 GDNF 的作用下分化。用 MPP+或携带有 α-synuclein 蛋白过表达基因的 baculovirus 病毒处理分化后的 LUHMES 细胞，诱 导细胞产生与多巴胺能神经元退行性变相似的细胞毒性。细胞的 ATP 水平以及 caspase 3/7 的活性作为评价细胞毒的指标。CDK2 抑制剂 GW8510 和 GSK3β 抑 制剂 SB216763 作为文献报道的化合物处理细胞，考察其对 MPP+和 α-synuclein 诱导的细胞毒的缓解作用。 结果：分化过程中，LUHMES 细胞逐渐能够表达多种多巴胺能神经元特有的 标志物，生长出延长的突起并成为有丝分裂后细胞，与神经元相似。MPP+能够 剂量依赖性地降低分化后的细胞 ATP 水平并升高 caspase 3/7 的活性。两种化合 物（GW8510 和 SB216763）均能够缓解 MPP+诱导的细胞毒，且 EC50 分别为 12 nmol/L 和 205 nmol/L。α-synuclein 蛋白过表达同样能够有效降低细胞 ATP 水平 及升高 Caspase 3/7 活性，但其产生的细胞毒只能被 GW8510 有效缓解，SB216763 作用不明显。 结论：我们建立了两种帕金森病相关的细胞毒模型，并使用文献报道的化合 物分别对两种模型进行了验证。为探寻或筛选治疗帕金森病方面具有神经元保护 作用的化合物，相比于需要高技术要求及规模有限的原代多巴胺能神经元，分化 后的 LUHMES 细胞将提供一种优良的平台。 关键字：帕金森病; 细胞毒; LUHMES 细胞; MPP+; α-synuclein IV Screening small molecules with neuroprotective activity by establishing Cell-based assays for Parkinson’s disease ABSTRACT Aim: Human mesencephalic neuron-derived LUHMES cells can be differentiated to post-mitotic cells with biochemical, morphological and functional features of dopaminergic neurons. In an effort to identify neuroprotective agents for Parkinson’s disease (PD), we developed cell-based cytotoxicity assays using differentiated LUHMES cells to model dopaminergic neuronal degeneration. Methods: LUHMES cells were cultured and differentiated using cAMP and GDNF. To induce cell death relevant to dopaminergic neuronal degeneration, the differentiated cells were treated with MPP+ or infected with baculovirus to overexpress α-synuclein. The cytotoxicity after the treatment was measured as intracellular ATP levels and caspase 3/7 activity. The CDK inhibitor GW8510 and the GSK3β inhibitor SB216763 were used as the reference compounds to rescue MPP+ or α-synuclein-induced toxicity. Results: During the differentiation, LUHMES cells gradually e