碱性成纤维细胞生长因子在活性全层皮肤构建中的作用-外科学专业论文.docxVIP

万 万方数据 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果 。论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在论文中以明 确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名而 久 杠日期_S月日 学位论文使用授权 声 明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档 ，允许论文被查阅 和借阅 ;学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文 ; 学校可以向国家有关 部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部 分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理 。 情签名: I却在位 日期俨》豆叶  导师签名 : Jr-号 ?:_.J二 日期drf 年二月中 万 万万数据 学位论文知识产权声明 本人郑重声明 : 我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下完成的 成果，该成果属于汕头大学医学院，受国家知识产权法保护。本人在毕业离 校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后使用与学位论文相关 的数据资料参加学术会议、公开报告、发表论文和申请基金等，须征得导师 及导师所在单位的同意。不得擅自对外披露本论文尚未公开的研究成果 。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担 。 ;二:;归结在用:;LU月 导师签名 : 介与三 L 日地主之二悔一ζ月一一 万方数据 万方数据 汕头大学医学院硕士学位论文 中文摘要 目 的 人工培养皮肤于 20 世纪 80 年代开发成功，开皮肤再生医学的先河。然而，人工培养 皮肤在形态和功能上与正常皮肤有较大的差距，因此培养皮肤质量的不断改良是研究者们 不懈努力的目标，更是临床应用的迫切需要。bFGF 又称为 FGF2，影响细胞的增殖、迁移 和分化。bFGF 不仅刺激成纤维细胞增殖和胶原蛋白的分泌，对血管新生也有强烈的促进 作用。基因重组 bFGF 在临床上已经有了较长时间的应用，对培养皮肤的构成细胞—成纤 维细胞以及表皮角化细胞都有直接或间接的影响。在活性全层皮肤的培养过程中添加 bFGF，对培养皮肤进行组织形态学以及细胞状态研究。我们期待 bFGF 的添加能够改善培 养皮肤的质量，同时以该培养皮肤为模型，探讨 bFGF 在皮肤创伤修复中的作用。 方 法 从手术时废弃的剩余正常皮肤分离出表皮角化细胞和成纤维细胞并体外培养扩增。采 用第 4 代表皮角化细胞构建全层活性皮肤（living skin equivalent, LSE），第 5 代真皮成纤维 细胞构建活性全层皮肤(LSE)。准备 I 型牛胶原溶液（Sigma 公司，美国) 6 容量，0.1N NaOH1 容量，8 倍浓度 DMEM1 容量，20%FCS/DMEM10 容量，将上述溶液在 4℃进行混合。每 个 insert (Transwel-COL, membrane pore size, 3 μm, Costar; Corning 公司，美国)中添加 1ml， 于室温静置 10 分钟，使其胶冻化。在 10%FCS/DMEM 培养基中，调制成纤维细胞为 5x105 个/ml。将该细胞悬液 2 容量与上述胶原混合液 8 容量进行混合，每个 insert 缓慢注入 3.5ml 后待其胶冻化，而后添加 10%FCS/DMEM 培养基，于细胞培养箱中静置。5 日后，在收缩 凹陷的胶原凝胶上播种表皮角化细胞，液相下培养 2 日待细胞达到融合后，开始气液面培 养。在培养基中添加 30ng/ml bFGF（珠海亿胜生物制药有限公司，中国），对照组添加等 剂量的无菌注射用水，每 2 日换液一次。在气液面培养后的不同时点（2 周、3 周、4 周） 采取 LSE 样本，进行石蜡包埋。制作 6μm 厚石蜡切片，进行 Hematoxylin-eosin(HE)染色 和免疫组织化学染色。图像由奥林帕斯 AX80 显微镜耦合奥林帕斯 DP50 数码相机 (Olympus 公司，日本)拍摄获取。采用 image-pro plus 6.0 (ipp)图像分析软件分别测量实验 组与对照组的真皮层厚度，统计结果以均数±标准误（??± S??）的形式表示，各周的两组数 据之间比较采用 t 检验，P 值0.05，P 值0.01 为有显著性差异。 结 果 I 汕头大学医学院硕士学位论文 一 组织学所见 HE 染色结果显示，气液面培养 2 周时，bFGF 添加组和未添加组的真皮厚度可见明显 差异。3 周、4 周，bFGF 添加组仍保留了较厚的真皮成分。 二 免疫组化染色 分化型 keratin 的表现 bFGF 非添加组 2 周、3 周，Kerati