姜黄素对血管平滑肌细胞胆固醇蓄积的影响及其与SREBP-1活性的关系-药理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 引 言 姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种 天然有效成分，可溶于甲醇、乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂，具有抗肿瘤、 抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化（As）等广泛的药理作用，而且毒性很低。目前，姜 黄素抗As的作用日益受到关注，主要集中在抗脂质过氧化[1-4]、抑增殖[5-6]、 降脂[7-9]、 抗炎[10]等方面， 其降脂作用大部分建立动物实验基础上，并在动物实验上证明姜黄 素降脂作用跟胆固醇代谢有关。但在细胞模型上，没有姜黄素对胆固醇代谢影响及其 相关机制的报道。 我们知道，在As中，VSMCs吞噬脂质(特别是氧化型低密度脂蛋白，ox-LDL)形成 泡沫化细胞的过程是As形成的最重要的环节。胆固醇在细胞内聚集的过程中，细胞内 CE占TC的比例不超过50％的荷脂细胞尚有较强的(早期)或一定的(中后期)外向转运 胆固醇的能力，所以VSMCs从迁移至内膜下开始吞噬脂质到演变成泡沫细胞的荷脂过 程是决定As进程与转归的关键时期。 SREBPs 是膜结合的转录因子和细胞内胆固醇代谢的重要调控蛋白,它定位于内质 网，由一个调节亚基和DNA结合亚基构成。调节亚基对细胞内游离胆固醇(FC)浓度高 度敏感，当细胞内FC浓度下降时，调节亚基与DNA结合亚基分离，后者进入核内与目 的基因序列中固醇反应元件(SRE)结合，调控基因转录[11-12]。而最近研究表明姜黄素 可引起HepG2细胞SRE-1基因表达上调。 Caveolin-1在细胞内胆固醇的摄取与流出方面起重要作用。一方面它参与B族I 型清道夫受体(SR-BI)介导的高密度脂蛋白受体(HDL受体)选择性吸收胆固醇及胆固 醇酯，吸收的胆固醇与Caveolin-1形成复合物，将之转运到相应的细胞器（内质网/ 高尔基体）中储存。另一方面，Caveolin-1能将新合成的细胞内胆固醇由内质网转移 到胞膜，促进胆固醇与胞外受体结合从而促进胆固醇的流出 [10,13,14]。同时文献报道， caveolin的基因序列上存在SRE，能被SREBPs识别，从而调节Caveolin-1的表达[15]。 所以我们推测姜黄素可能通过影响SREBPs的活性进而调节Caveolin-1的表达来影响 VSMCs源性荷脂细胞内胆固醇的摄取和逆向转运。 综上所述，本课题拟在细胞模型上研究姜黄素对VSMCs胆固醇蓄积的影响及 Caveolin-1表达变化，同时探讨它们与SREBP-1活性的关系. 实 验 材 料 一 实验动物 雌性 Sprague–Dawley 大鼠购自南华大学实验动物中心。 二 主要试剂和来源 1. 姜黄素，Sigma公司, 用DMSO溶解； 2. 细胞培养液：DMEM 粉末为 Gibco（USA）公司产品； 3. 新生牛血清，杭州四季清公司，临用时56℃水浴30分钟灭活； 4. 胰蛋白酶，美国Hyclone公司； BCA 蛋白定量试剂盒，Hyclone．Pierce公司； Western 印迹荧光检测试剂盒，Hyclone．Pierce公司； 7. 蛋白印迹PVDF膜、HEPES购自北京利科生化有限公司； 8. Caveolin一抗、SREBP-1一抗、辣根过氧化物酶标记鼠抗兔二抗为Santa Cruz公司 产品； 9. 聚丙烯酰胺、亚甲基聚丙烯酰胺、考马斯亮蓝、TEMED、过硫酸胺均购自长沙金 泰克公司，为 Sigma（USA）产品； 10. 丽春红染色试剂，Sigma公司； 11. 油红O，Sigma公司； 12. 乙腈、甲醇，色谱纯，美国Tedia公司； 其他试剂均为进口或国产分析纯。 二 主要仪器及设备 1 CO2 培养箱，美国 Shill 公司产品； 2 超净台，苏州净化设备公司生产； 3 高速离心机为德国 Eppendorf 公司产品，5804 型及 5804R 型； 4 80P-7型超速离心机，日本Hitachi公司； 5 Elx-800酶联免疫检测仪由美国Bio-Tek公司生产； 6 垂直电泳仪及转膜系统为美国BioRad公司产品；卧式电泳槽购自北京六一仪器厂； 7 微量移液器（2μl、10μl 、20μl 、100μl 、1000μl）为德国Eppendorf公司 产品； 8 电子分析天平为美国Sartorius公司产品； 9 超低温冰箱为日本三洋公司产品； 10 倒置显微镜是日本NIKON公司生产； 11 高效液相色谱仪，日本三洋公司。 实 验 方 法 1.细胞培养 贴块法进行 SD 大鼠胸主动脉 VSMCs 原代培养，倒置相差显微镜下观察，细胞为 梭形，具典型峰谷生长状态。待细胞长满后用 0.125％的胰蛋白酶传代。取 3～8 代 细胞进行实验。细胞用含有 10％胎牛血清 DMEM