金属硫蛋白在小鼠心脏缺血再灌注损伤中的保护作用-外科学(胸外)专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2013 届硕士研究生论文 PAGE PAGE 10 HYPERLINK \l _bookmark18 5.结论 53 HYPERLINK \l _bookmark19 参考文献 54 HYPERLINK \l _bookmark20 Abstract 57 HYPERLINK \l _bookmark21 致谢 59 HYPERLINK \l _bookmark22 缩略词表 60 HYPERLINK \l _bookmark23 学位论文独创性声明 62 HYPERLINK \l _bookmark24 综述 63 摘 要 随着医疗技术水平的不断发展，器官移植目前已经成为心、肺、肝、肾等 重要器官终末病症治疗的主要方式，并且适应范围和求量日益增加。虽然，随着 人 HLA 配型和环孢素、他克莫斯等新型免疫抑制剂的开发与应用，器官移植后 的免疫排斥反应得到了更有效的控制，大大延长了移植器官的存活期；但是，由 于供体器官在移植过程中离体缺血和移植后血流复通所引起的缺血再灌注损伤， 供体器官的移植存活受到了极大的限制。为了更好地提高供体器官的移植存活 率，减轻供体器官缺血再灌注损伤成为了器官移植的一大研究方向。 心脏移植是器官移植中的重要部分，是终末期心力衰竭的有效治疗方法。 心脏在移植过程中，心肌细胞处于缺氧、冷休克环境，会引发部分心肌细胞的坏 死和暂时性的功能受损。而近来大量报道指出，心脏缺血再灌注损伤的主要阶段 是集中在缺血后再灌注复流的这一时间段内。在心脏缺血再灌注损伤过程中，氧 自由基所介导的细胞毒性反应发挥着关键作用；引发了 G 蛋白、腺苷酸环化酶 的功能异常以及 ATP 酶活性的改变；并对血管内皮细胞、肌肉细胞和神经细胞 等造成严重影响。病理表现为心肌细胞坏死、凋亡，线粒体功能障碍，脂质过氧 化物增加，自由基大量生成。缺血再灌注损伤在临床上可引发复流后心脏顿抑、 再灌注性心率失常和心肌坏死，并导致恶性心律失常的发生，左心室收缩力减弱、 室内压下降等心肌功能减退的表现。最终，导致心脏移植存活效率并不高。如何 有效地减轻心脏移植过程中的供心缺血再灌注损伤成为了研究的热点。 1957 年，美国科学家 Margoshoes 在研究金属生物学作用时，从动物器官 中分离出一种镉的金属蛋白质。由于它是一种低分子量、高巯基含量、能大量结 合重金属离子的金属蛋白质，因此称为金属硫蛋白（Metallothionein，简称 MT）， MT 分子呈椭圆形，分两个结构域,分子量为 6,000～8,000 道尔顿,直径 30～50 A, 含有 61 个氨基酸,其中 20 个氨基酸为半胱氨酸，少数有 21 个,这样每一个 MT 分 子就可以结合 7～12 个金属离子。人体、动物、植物以及微生物体内均含有 MT， 而且其理化特性基本一致，具有特殊的吸光性。MT 构象较坚固,具有较强的耐热 性。 MT 的重要生理功能表现在它是一种目前所知的最有效的自由基清除剂， 其清除自由基（·OH）的能力约为超氧化物歧化酶(SOD)的几千倍，而清除氧 自由基（·O）的能力约是谷胱甘肽（GSH）的 25 倍，而且具有很强的抗氧化 活动。MT 作为一种强的内源性细胞保护蛋白，在心血管系统抗损伤保护中发挥 着重要作用，主要表现在对缺血再灌注损伤的抑制作用。临床实践证明，缺血预 处理能提高体内 MT 含量，并通过保护氧化酶活力减轻心肌细胞缺氧/复氧所导 致的心肌损伤。 MT 目前的主要制造工艺是动物肝脏提取法，由于动物肝脏提取法提取量 小、工艺复杂、成本高、产量低。这些问题严重限制了 MT 在临床上的研究和应 用。本课题通过选取改良的九州虫草菌种，并采用生物发酵方法，生产、提取金 属硫蛋白，同时利用所提取的金属硫蛋白，观察其在小鼠心脏移植过程中对冷缺 血再灌注损伤的影响。本课题尝试开发一种更经济、简便、有效的金属硫蛋白生 产工艺，并探讨外源性金属硫蛋白在供体心脏缺血再灌注损伤中的保护机制，不 仅为金属硫蛋白在治疗供心缺血再灌注损伤方面提供了理论依据，而且为其临床 应用提供了新思路。 第 一 部 分 九 州 虫 草 金 属 硫 蛋 白 的 诱 导 ， 提 纯 及 性质 研 究 目的：以生物发酵工程为手段，探寻一种经济、高效、简便的金属硫蛋白 生产工艺，并用正交试验法优选出最适的生产提取条件。方法：以经过基因工程 改良的九州虫草真菌为菌种,采用液态深层发酵法发酵、ZnSO4 法增殖菌丝体并诱 导其合成金属硫蛋白；待菌丝体成熟后经细胞破碎、粗提取和 Sephadex G-50 柱层析等步骤，得到锌金属硫蛋白，并通过统计分析九州虫草菌丝体金属硫蛋白 的产率，得出硫酸锌诱导虫草金属硫蛋白的最佳条件。提纯后，对所提取的金属 硫蛋