人参classIII几丁质酶Gchi1基因克隆和原核表达研究.docxVIP

人参classIII几丁质酶Gchil基因克隆和原核表达研究 摘要：几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是 病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏细胞新物质 的沉积，激发寄主植物的抗病反应，使病原真菌细胞壁中的 几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的 酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本研究 通过几丁质酶基因的克隆，构建原核表达载体pET-28a （ + ） -Gchil,利用IPTG诱导表达，经PAGE分析表明，该基因表 达的蛋白分子量为34kD左右，其表达产物主要以包涵体的 形式存在。抑菌圈试验发现，IPTG浓度为0. 6mmol/L时抑菌 效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物品种， 提高作物抗病性具有重要参考价值。 关键词：人参；几丁质酶；基因；分析 中图分类号：S567. 51文献标识码：A 1前言 几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞 壁的主要成分，几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成 的几丁质，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新 物质的沉积，致使病原体死亡，且所产生的细胞壁碎片具有 诱导作用，可激发寄主植物的抗病反应［1］。植物几丁质酶 具有广泛的生理活性［2］,尤其在植物抗病方面具有重要作 用［3］。 研究发现几丁质酶参与植物的发育调控：植物几丁质酶 基因的表达具有组织特异性，参与了植物的发育调控。如几 丁质酶参与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程。几丁质参与共 生作用：几丁质酶可以降解固氮菌的结瘤因子，Minic等研 究苜蓿中的几丁质酶对某些结瘤因子具有降解作用。所以几 丁质酶通过控制结瘤因子水平来使植物与根瘤菌达到共生 平衡，而不产生过量的根瘤。此外，几丁质酶对结瘤因子的 降解具有专化性，可能是决定根瘤菌的寄主专化性的因素之 一［5］。本研究旨在通过构建几丁质酶表达载体制备几丁质 酶，用于抗真菌等方面的相关研究。 2材料与方法 2. 1实验材料 人参由吉林农业大学基因工程实验室培育。大肠杆菌菌 株为DH5- a ,原核表达载体pET-28a ( + )、BL21均是由吉林 农业大学生命科学学院基因工程实验室保存。质粒小提试剂 盒、ExTaq酶、solutionl连接酶、限制性内切酶、分子量 标准DL-2, 000购自大连宝生物公司。异丙基-B-D-硫代半 乳糖昔(IPTG)等均购自北京鼎国生物公司。植物基因组DNA 小量提取试剂盒、DNA切胶回收试剂盒及清洁试剂为美国 Axygene公司产品。引物和测序均由上海生工公司完成。 2.2实验方法 2. 2. 1人参Gchil基因扩增 按 GenBank 中人参 Gchil 基因序列(GenelD： DQ532359) 及pET-28a ( + )原核表达载体的多克隆位点设计特异引物， 并在引物两端分别加酶切位点。上游引物序列为5 CAA TTA ggA TCC ATg gCA TCT CAT TTg TCg 3\ 含有 Xho I 酶切位 点(下划线)。下游引物序列为5’ CTA TAT CTC gAg TCA CAC ATC gCT CTT gAT3?含有BamH I酶切位点(下划线)。采用 上述引物进行PCR扩增反应，以人参cDNA为模板，反应程 序如下：94￡预变性8分钟；9/C变性30秒，62￡退火30 秒，72。(2延伸30秒，35个循环；反应结束后用1%的琼脂糖 凝胶电泳检测。 2. 2. 2人参Gchil基因原核表达载体的构建 将纯化后的PCR产物用Xhol及BamHI进行双酶切，同 时对pET-28a ( + )质粒进行双酶切，然后进行去磷酸化处理, 构建重组载体pET-28a ( + ) -Gchilo将此重组载体转化感受 态大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行PCR及酶切鉴定，将鉴定 后质粒送至上海生工公司完成测序鉴定。 2.2.3目的蛋白的诱导表达及检测 将含有表达载体pET-28a ( + ) -Gchil的大肠杆菌振荡 培养至0D600=0. 6时，加入终浓度分别为0. 4、0.6、0. 8和 1.0 mM/L 的 IPTG。30°C, 200 rpm/min 振荡培养，诱导表达 5h后，离心收集菌体，菌体以含0. 2mg/ml溶菌酶和10 mM DTT 的磷酸钠缓冲液(20 mM, pH 7.2 )悬浮，反复冻融4次, 以超声波破碎后的样品离心，收集上清液进行PAGE检测。 2. 2.4目的蛋白活性鉴定 目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定，将锈腐菌接 种到PDA培养基，使其在251下生长1周左右。用直径lcm 沾有上清液的滤纸放到菌丝边缘，以沾有无菌水的滤纸为对 照，一周之后观察生长情况。以平板上菌落周围抑菌圈的有 无和大小确定菌株是否诱导表达几丁质酶，以及所产几丁质 酶的活性。