白血病检测的几种方法与甲基化监测在临床中的.doc

PAGE PAGE 1 白血病检测的几种方法与甲基化监测在临床中的 丁肖华何蕴韶 作者单位：510080广州，中山大学中山医学院解剖学教研室 白血病是血液系统的恶性克隆性疾病，正确的诊断及分型对指导治疗至关重要。1976年FAB分型方案是以形态学及细胞化学为基础的诊断分型方法。上世纪８０年代中期，随着多种生物医学科学技术的发展和应用，又逐渐形成了白血病的MIC(形态学、免疫学、细胞遗传学)分型方案，几种方法互相结合互补，大大提高了诊断的准确性，为指导临床治疗和判断预后提供了宝贵的资料，但是临床诊断主要是依据骨髓形态学异常，核型变化和细胞周期的延长三者从不同侧面反映目前状态[1]。 1目前常用的白血病检测方法 1.1形态学检查 常规染色分类，同时进行细胞化学染色，包括髓过氧化物酶、糖原染色、A2醋酸奈酚酯酶及氟化钠抑制等试验。骨髓细胞形态学检查在血液病的诊断中有重要价值，可直接确诊各种类型白血病，并可发现多发性骨髓瘤、骨髓转移癌等[2]。根据骨髓细胞不同的增生度及形态变化提示贫血类疾病的病因诊断，如缺铁性、溶血性、再生障碍性贫血等[3]。但白血病细胞的高度异质性和多态性,重复性差，易受主观因素的影响，其诊断一致率约60%～80%[4]。进一步的确诊往往需要进行细胞免疫学，遗传学和分子生物学等方法的检测。 1.2免疫学检测 免疫学检测急性白血病微小残留病变（MRD）的主要方法有两种:细胞涂片法和FCM。细胞涂片法所需设备简单，可在显微镜下清楚地判断细胞抗原和抗体结合的部位，尤其对细胞内抗原进行检测时较易排除因细胞膜渗透处理带来的非特异性反应，但目测不易对大量细胞进行计数，故敏感度较低，一般为10-2,目前主要用于细胞内抗原的检测；而FCM可同时对同一细胞中２个以上的抗原进行检测，并对大量细胞行快速分析，准确客观、简单方便。实验证明对其流动系统进行反复和长时间清洗后，检测MRD可获得的最高敏感度是10-6,但实际操作中一般达到的是10-4[5]。 MIC协作组认为细胞形态学对急性白血病诊断具有重要性,但更应该结合免疫学和细胞遗传学进行分析[6]。免疫分型是目前诊断白血病不可缺少的重要指标。近年来国际上公认和通用的方法是用流式细胞技术免疫分型[7]。流式细胞技术的基本原理,就是让激光束照射高速流动的荧光标记的单细胞流,激光的吸收和反射所产生的各种光学参数会被机器分析,然后用图像表达出来。这些光学参数包括细胞的物理参数和各种荧光强度[8]。 1.3细胞遗传学检测 取患者骨髓细胞,常规应用直接法或短期培养法进行染色体RHG显带。分析细胞的染色体核型均是t(15;17)(q22;q21)易位者为单纯型,除t(15;17)核型改变外,还伴有其它核型异常者为复杂型[9]。染色体核型的检测不仅对AL的诊断有关，并且与治疗方案选择及预后有关。在60%的急性髓细胞白血病(AML)病人中有特异性染色体变化，如M2/t(8;21)、M1/t(9;22)、M4EO/inv/(16)、M3/t(15;17)等,这些特征性染色体异常也反映在对各种治疗的反应[4]。但是白血病细胞分裂指数低,染色体形态短小,常显带不清,使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别[10]。 1.4荧光原位杂交（ＦＩＳＨ） FISH技术灵敏度高，取材方便，骨髓或外周血均可作为研究对象，不仅对分裂中期细胞，而且对间期核细胞均能检测到，对隐匿型、变异型也可同样进行检测分析，是直观、敏感、快速、特异的诊断方法。FISH相关技术在白血病的染色体结构和数量畸变的分析与检测应用方面，已日趋完善。应用基因特异性探针，可检测大多数染色体重排、易位、倒位等结构改变[11]。但是，常用的双色单融合探针检测bcr/abl融合基因时,由于bcr和abl基因信号空间上的随机分布或光学重叠,可造成4%～10%的假阳性率[12，13]。过高的假阳性率不仅影响到灵敏度与特异性,还可一定程度上影响研究者对实验结果的解释。 1.5人血清铜蓝蛋白检测 血清铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,CP)是一种急性期反应蛋白,也是非特异性肿瘤发生的标志物,其血清中含量在多种恶性肿瘤中均有明显增高。对血液系统疾病CP水平测定及观察认为[14]:①测定血清CP水平对血液系统肿瘤的诊断及与非肿瘤性血液病的鉴别诊断有指导意义;②测定淋巴瘤病人CP水平对指导其分期及病情估价具有重要意义;③测定CP水平有助于估测白血病病人的肿瘤负荷及评价白血病的化疗效果。 1.6端粒酶检测 端粒是真核细胞染色体末端(TTAGGG)n重复序列结构,对维持染色体的稳定具有重要作用。端粒的长短及稳定性决定细胞寿命,与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒DNA是由端粒酶控制合成的,端粒酶是RNA依赖的DNA聚合酶,其激活是细胞获永生化及形成恶性肿瘤的一个重