固氮施氏假单胞菌RpoN和RpoS对鞭毛合成和趋化调控机制的研究-细胞生物学专业论文.docxVIP

独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽 农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名:刻 θL 签字日期 :ν3年 6Ji i日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规莲，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件， 允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论文全文数据 库))，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社 会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)。 学位论文作者签名湖必头 指导教师签名:绝么给 签字日期 : /3年 4月 b 日 签字日期:刘少年 4月 4 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通信地扑· 邮编: 摘要 在自然界中，为了适应复杂多变的外界环境，原核生物需要通过诱导不同σ因子 来调控特定基因的转录与表达。σ因子在微生物的进化过程中产生了种类和功能上的 差异。根据结构和功能可将其可分为两类：σN因子和σ70家族因子。目前研究较为深 入的σ因子为σ70、σ54和σ38。对σ因子的研究大多数都是在转录组水平上，随着研究的 深入发现转录因子的调节是一个十分复杂的过程，是诸多因素作用的结果。在原核生 物中，其通常以多重调控网络的方式来调节某一外界的刺激应答，许多证据显示转录 的激活取决于大量的转录因子的相互作用。在大肠杆菌中发现多个σ因子协同或拮抗 调控趋化、鞭毛合成等某些特殊基因的表达。假单胞菌中是否存在和大肠杆菌相类似 的调控机制，目前仍不清楚。本研究以施氏假单胞菌A1501为研究对象，构建了rpoN 缺失突变株ΔrpoN及其功能互补菌株Comp-rpoN。并利用实验室已有的rpoS缺失突变 株ΔrpoS，就RpoN和RpoS对菌株鞭毛合成与趋化的调控进行了相关研究。并取得了 以下主要结果： 1.利用三亲本结合的方法构建了rpoN基因缺失突变株和功能回补株。 2.LB培养基中，ΔrpoN生长非常缓慢，稳定期的菌体密度只有野生型的50%；Co mp-rpoN的生长恢复到野生型的80%——即rpoN基因突变影响了菌株在正常条件下 的生长。而rpoS基因的缺失对菌株生长并没有显著的影响。分别以2MNacl冲击、20m M H2O2冲击处理，ΔrpoS对盐冲击和H2O2冲击比较敏感，ΔrpoS存活率明显下降；而 以50℃热冲击后，ΔrpoS的存活率与野生型没有明显差异。 3.在固氮条件下，rpoN基因的缺失使得菌体丧失了固氮能力，Comp-rpoN的固氮 酶活性仅恢复到野生型的30%；ΔrpoS的固氮酶活性下降到野生型的75%。 4.趋化实验表明ΔrpoN趋化能力丧失，ΔrpoN丧失了趋化能力，而ΔrpoS趋化能 力却增强了。通过透射电镜观察发现，rpoN突变株为鞭毛合成缺陷体；rpoS突变后菌 体鞭毛与野生型相比更细、更长。 5.通过phyre2分析发现，RpoN蛋白具有7个α螺旋结构和2个β折叠结构。RpoN具 有三个功能结构域，C末端具有保守的RpoN-BoX保守序列：421-IAGLLEAQGIQVA RRTVAKYRESLGIAPSSERKRLL-457。RpoS蛋白具有14个α螺旋结构及1个β折叠结 构。该蛋白C端DNA-binding氨基酸序列：286-EASTLEEVGQEIGLTRERVRQIQVEA LRRLREILERNGLSSDALFQ-332。通过Weblogo预测A1501中依赖RpoN启动子保守 结合序列为TGGCACNNNNNTTGC，依赖RpoS启动子保守结合序列为CTANNNTG。 6.利用pTwin1载体构建了pT-rpoN融合表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中导入p T-rpoN表达了RpoN蛋白，并以几丁质柱对其进行纯化。选择鞭毛等级调控系统中的 I II II 关键调控基因fliA，扩增其上游300bp的序列为探针，通过凝胶阻滞实验发现其与Rpo S结合。而没有发现RpoN与fliA探针有结合现象。 7.水稻根系竞争定殖实验显示，rpoN基因的缺失使得菌株的定殖能力显著下降； 而ΔrpoS定殖于水稻根系的能力稍有提高。 关键词：施氏假单胞菌 A1501，RpoN，RpoS，鞭毛合成，趋化 III III Abstract In order to adapt to the c