光漂白机理与荧光共振能量转移效率实时测量技术的研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文摘要 华中科技大学博士学位论文 摘要 本文介绍了作者关于光漂白机理和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer,FRET)效率实时测量两个方面的理论和实验研究成果。 提出了一种全新的D．O和D—P光漂白(Photobleaching)理论模型。光氧化反应 (D．O机制)和激发光予与处于激发态荧光分子间的相互作用(D．P机制)是光漂 白的两种机制。D一0光漂白事件发生在第一激发三线态，而D．P光漂白事件发生在 第一激发单线态，而且是一种快速光漂白机制。 D．O光漂白速率和荧光基团分子处于激发态几率间的依赖关系与激发方式无 关，但是D．P光漂白速率的依赖关系却与激发方式紧密相关。D．0光漂白速率总是 线性依赖于荧光基团分子处于激发态的几率，但是D．P光漂白速率与荧光基团分子 处于激发态几率间的关系却依赖于激发光的强度水平和荧光基团分子的浓度。 详细分析了单个D．O和D—P光漂白事件的作用方式，并在此基础上分别给出了 单光子激发和多光子激发条件下，光漂白速率与荧光基团分子处于激发态的几率或 者激发光强度间的定量依赖关系。单光子激发时，光漂白速率总是与荧光基团分子 处于激发态的几率成线性关系：双光子激发时的光漂白速率与荧光基团分子处于激 发态的几率的关系依赖于激发方式：在生物成像水平下成非线性的高次依赖关系， 但是在单分子水平下却成线性依赖关系。 提出了一种在活体细胞内测量光漂白速率与激发光强度之间依赖关系的方法。 该方法对离体样品的实验结果表明：单光子激发时的光漂白速率与激发光强度成线 性关系，双光子激发时的光漂白速率与激发光的强度成高次非线性关系，而不是期 望的平方关系。 在高浓度条件下，研究了表达在活体HeLa细胞内的若丹明B(RhB)、若丹明 123(R．h123)和荧光素等化学探针以及基因荧光探针(GYP)的光漂白特性。分别测量了 在单光子激发和双光子激发时的光漂白速率与激发光强度之间的依赖关系。单光子 激发时的光漂白速率与激发光强度成线性关系；化学荧光探针的双光子激发光漂白 速率约依赖激发光强度的3．6次方，而对GFPs却接近4次方。 研究了单个RhB分子的双光子激发光漂白寿命与激发光强度间的依赖关系。实 验结果表明：与高浓度条件下的光漂白实验结果不同，单分子水平的双光子激发光 漂白寿命与激发光强度的平方成反比，即单分子光漂白速率与荧光基团分子处于激 华中科技大学博士学位论文====∞=============≈===========≈=；=====一=== 华中科技大学博士学位论文 ====∞=============≈===========≈=；=====一=== 发态的几率成线性依赖关系，该结果与D．O和D—P光漂白理论的推论一致。 针对供体受体之间浓度比一定的情况，提出了一种双通道实时监测FRET效率 的方法。FRET效应的双通道实时监测方法只需一次测量就可以获得FRET效率。 GFP已经成为活体原位研究的重要荧光基因探针，基于GFP的FRET功能型荧光探 针也已经获得广泛的应用。一般而言，基于GFP的FRET功能型探针都具有固定的 供体受体浓度比，因此双通道实时监测FRET效率的方法特别适合应用于基于GFP 的FRET荧光探针。 提出了一种基于FRET效应的测量供体受体吸收截面之比的新方法，并且利用 该方法测量了YFP和CFP在730．930nm范围内的双光子激发吸收截面之比。测量结 果表明在780．810rim范围内YFP和CFP的双光子激发吸收截面之比很低，说明在此 范围内的激发光选择性地激发Cameleon的供体CFP。 提出了一种通过测量供体受体联合发射光谱拟合FRET效率的方法。事实上不 需扫描获得整个发射谱，而只需扫描获得供体和受体发射峰值附近的发射光谱即可 通过该方法拟合得到FRET效率。 关键词：光漂白 单光子激发 多光子激发 荧光能量共振转移(FRET) II ． 华中科技大学博士学位论文Abstract 华中科技大学博士学位论文 Abstract This dissertation expounds some achievements in the theory and the experiment for both the photobleaching mechanism and the monitoring in real—time of fluorescence resonance energy transfer(FRET)efficiency． A new theory model of D—O and D—P photobleaching is proposed．The oxidative reaction(