吉非替尼对奥沙利铂体外抗睾丸癌作用的影响及可能机制-药理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 吉非替尼对奥沙利铂体外抗睾丸癌作用的影响及可能机制 中文摘要 目的： 1. 观察吉非替尼（gefitineb）对睾丸间质肿瘤（I-10）细胞间缝隙连接（gap junction， GJ）功能的影响。 2. 观察吉非替尼与奥沙利铂（oxaliplatin，OHP）合用对 I-10 细胞生存率及凋亡 的影响并探讨其可能机制。 3. 探讨吉非替尼增强 I-10 细胞 GJ 功能的激酶（PKC、src）调节机制。 方法： 1. MTT 法检测药物对 I-10 细胞生长的影响。 2. 细胞荧光示踪法（parachute）检测 I-10 细胞间的 GJ 功能。 3. 细胞免疫荧光法检测 I-10 细胞膜上 Cx43 的表达。 4. Western blot 法检测 I-10 细胞中 Cx43、磷酸化 Cx43、激酶 PKC、src、凋亡蛋 白 Bax、Bcl-2、caspase 3、9 的表达。 5. Annexin V-FITC/PI 双染法和 Hoechst 33258 法分别检测 I-10 细胞的早期和晚 期凋亡。 结果： 1. 0~5 μM（0.25、0.5、1、2 μM）的吉非替尼显著增强 I-10 细胞间的荧光传递能 力及细胞膜上 Cx43 的蛋白表达。与对照组相比，吉非替尼药物组的 GJ 荧光传 递分别增强 40.17%±18.4%（P0.05）、190.43%±11.5%（P0.01）、167.81% ±9.8%（P0.01）、153.38%±10.4%（P0.01），其中浓度在 0.5 μM 作用时的 作用最强。 2. 实验中选用 0.5 μM 的吉非替尼与不同浓度的 OHP 合用，观察其对 I-10 细胞 的毒性作用。与单用 OHP 比较，40 μM 的 OHP 与吉非替尼合用时细胞毒性作用 显著增强（P0.01）；40 μM OHP 与吉非替尼合用对 I-10 细胞的早期和晚期凋 亡进行检测，结果发现与 OHP 单用组相比，合用组的早期和晚期凋亡率分别增 加了 32.6%±14.2%和 30.5%±9.7%（均 P0.05）。 3. 细胞荧光示踪法检测细胞 GJ 功能结果表明，与 OHP 单用组相比，合用组（吉 非替尼+OHP）的 GJ 荧光传递能力增强 180%±30.6%（P0.01），膜 Cx43 表达 亦显著增强；Western blot 检测 Cx43 总蛋白和磷酸化蛋白结果表明，与 OHP 单 用组相比，合用组（吉非替尼+OHP）的 Cx43 总蛋白表达增加了 170.43%±23.3%， 磷酸化水平降低了 57.94%±10.3%（均 P0.01）。 4. Western blot 检测检测细胞凋亡相关蛋白结果表明，与 OHP 单用组相比，合用 组（吉非替尼+OHP）凋亡蛋白 Bax/Bcl-2 的比值增加了 63.05%±15.4 %、剪切 的 caspase 3、9 表达分别增加了 43.2%±5.2%和 32.5%±6.2%，结果有统计学意 义（均 P0.01）。 5. 吉非替尼作用 I-10 细胞后，src、PKC 激酶的表达降低，与对照组相比有统计 学意义（P0.05）。选用 src 激酶抑制剂 PP2 和 PKC 激酶抑制剂 GF109203X 作 用 I-10 细胞后可显著增强 GJ 功能，并且细胞膜蛋白表达增加，Cx43 磷酸化水 平降低，与对照组相比差异均有显著性（P0.01）。结果提示吉非替尼增加 I-10 的 GJ 功能可能与其抑制 src 和 PKC 的表达有关。 结论： 1. 吉非替尼增强 I-10 细胞的 GJ 功能，该作用与磷酸化 Cx43 蛋白表达降低有关。 2. 磷酸化 Cx43 水平降低与 src 和 PKC 激酶水平降低有关。 3. 吉非替尼与 OHP 合用可显著增强 OHP 的细胞毒性和凋亡诱导作用，该作用 与吉非替尼增强细胞的 GJ 功能，Bax/Bcl-2 比率增高、caspase 3、9 剪切增多有 关。 关键词：吉非替尼；奥沙利铂；缝隙连接；磷酸化；凋亡 Influence of gefitineb on the cytotoxicity of oxaliplatin in testicular interstitial cells in vitro and its possible mechanism Abstract Objectives: To determine the effect of gefitineb on the function of gap junction (GJ) in testicular cancer I-10 cells. To determine the effect of gefitine