活细胞内GLUT4囊泡纳米级三维实时定位技术的研究-生物物理学专业论文.docxVIP

A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Science Research on technique for real-time 3D localization of GLUT4 vesicles in live cells with nano-precision Candidate ： Qu Feng Major ： Biophysics Supervisor ： Prof. Qu Anlian Huazhong University of Science and Technology Wuhan 430074, P.R.China 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本论文属于 保密□ ，在 年解密后适用本授权书。 不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签 名： 日期：年 日期： 年 月 日 期： 年 月 日 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要* 葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）在肌肉细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取过程中起着 重要作用。有研究表明，GLUT4 响应胰岛素刺激向细胞膜募集，促进细胞对葡萄糖 的摄取。这一过程的失调与Ⅱ型糖尿病相关。研究活细胞内 GLUT4 囊泡的转运过 程，可以进一步加深对Ⅱ型糖尿病发病机理的研究，并寻找更有效的治疗手段。由 于三维单微粒定位技术的局限性以及所使用的荧光标记物易于漂白且荧光强度相对 较弱的缺陷，目前对 GLUT4 胞内转运机制的研究仅局限于观察 GLUT4 囊泡在细胞 内转运的某些短时程或者局部区域的片段。在三维空间内对 GLUT4 进行长时程的 实时定位，能够为研究活细胞内 GLUT4 的转运过程提供新的证据。本文的目的就 是研究和开发一种活细胞内 GLUT4 囊泡纳米级三维实时定位技术，为我们研究活 细胞内 GLUT4 转运提供新的手段。 本文利用量子点（QDs）标记活细胞内的 GLUT4。由于 QDs 具有激发光谱宽、 发射光谱窄、荧光亮度高以及耐光漂白等优点，所以标记了 QDs 的 GLUT4 克服了 传统荧光标记物荧光图像信噪比低及不能够进行长时程成像观察的缺点。同时，利 用荧光点离焦图像与离焦距离的关系，可以设计单微粒纳米级三维实时定位算法， 构建单微粒纳米级三维实时定位系统。本文主要内容如下： （1）研究 QDs 标记活细胞内 GLUT4 的实验方法。通过一系列实验，我们利用 调节反应温度和试剂浓度的方法，标记了活细胞表面的 GLUT4，并观察 GLUT4 在 活细胞撤去胰岛素刺激的状态下胞吞进入特定细胞器的过程。通过实验证明利用 QDs 标记活细胞内 GLUT4 的实验方法具有特异性强、灵敏度高、光毒性小且容易 被检测的优点。 （2）设计单微粒纳米级三维实时定位算法。通过实验和计算，推导出实验室所 用荧光显微成像系统中荧光点离焦图像最外层圆环半径与离焦距离的关系，并进一 * 本论文工作由国家自然科学基金项目支持 I 步推导出利用离焦图像最外层圆环半径计算离焦距离的公式。继而为实现单微粒纳 米级三维实时定位设计图像处理算法，包括荧光图像的预处理算法、通过迭代的质 心算法计算荧光点 X-Y 平面上的位置以及测量离焦图像最外层圆环半径以计算荧 光点离焦距离的算法。 （3）研究并开发单微粒纳米级实时定位系统。为将单微粒纳米级三维实时定位 算法应用到实验中，我们设计了一套单微粒纳米级实时定位系统。该系统包括硬件 和软件部分。硬件部分主要由本实验室自主研发的仪器结合倒置显微镜和 CCD 组 成。软件部分包含对系统硬件部分各单元的控制，并结合了单微粒纳米级三维实时 定位算法。 关键词：葡萄糖转运蛋白 4；量子点；单微粒纳米级三维实时定位；离焦图像；压 电微操作控制器 II PAGE PAGE III Abstract* The G