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5. 耐热DNA聚合酶 指在高温下具有活性的DNA聚合酶，主要用于PCR反应。 6. 逆转录酶 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）： 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 （1）来源 RNA肿瘤病毒。 （2）AMV的性质 由?和?两条多肽链组成。 ②产生新的酶切位点 ③对基因组作图的影响 第三节 DNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 噬菌体DNA聚合酶 4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 耐热DNA聚合酶 6. 反转录酶 7.末端转移酶 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 二、常用的DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同。 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 ①一条单链多肽。 ④ 5’?3’外切酶活性位于N端。 ⑤用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。 ②5’?3’ DNA聚合酶活性。 ③5’?3’外切酶活性 ① 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） ② Mg2+ ③ 带有3’—OH游离端的引物 ④ DNA模板 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 -OH 5’ 3’ dNTPs 标记 ① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。 （3）用DNA聚合酶I 制备探针 已知序列的核酸片断 显示位置 与互补的待测序列杂交 标记 已知序列的核酸片断 ② 探针的标记方式 标记 已知序列的核酸片断 带有放射性的已知序列的核酸片断 5’ 3’ ③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 切口转移法(nick translation )： 放射性同位素标记： DNA聚合酶I 同时具备5’?3’外切酶活性和5’?3’的聚合酶活性（以及3’?5’外切酶活性）。 5’?3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。 切口 切口 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 纯化的DNA片断 DNase I 制造单链切口 DNA Pol I 进行切口转移 一种?-32P-dNTP和dNTPs 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 32P-dNTP 32P-dNTP 从头至尾都被标记 8 2. Klenow fragment 具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 （1）Klenow fragment的性质 DNA Pol I ? Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶 ① 3’端补平 5’ 5’ klenow ② DNA 3’末端标记 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow （2）主要用途 3’隐蔽末端的DNA片断 Klenow fragment补平 根据末端的顺序选择一种 ?-32P-dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5’----G3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAA3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAATT3’ 3’----CTTAA5’ 5’----G3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GG3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GGATC3’ 3’----CCTAG5’ EcoR I BamH I ?-32P-dATP ?-32P-dGTP 25oC 1h ③ cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 （1） T4 DNA聚合酶的性质 3. T4 DNA聚合酶 从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。 有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（约为Klenow 片段活性的200倍）。 ① 来源 ② 酶活性 ③ 特点 当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。 如果只有一种dNTP，则降