棉花黄萎病菌GFP标记转化子的特征及其病害的生物防治-植物病理学专业毕业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 棉花黄萎病(Cotton Verticillium Wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵 染棉花引发的世界性棉花重要病害。它属于土传病害，具有分布广、危害重、寄 主范围广、传播途径多、存活时间久等特征。由于棉花黄萎病菌变异性较大，常 因环境条件的影响而产生新的生理类型，给黄萎病的防治造成一定的困难。明确 其侵染模式及致病机制可以为防治该病提供重要的理论基础。绿色荧光蛋白(GFP) 基因可以为侵染的研究提供方法和手段，因此本实验研究了将GFP基因转化进入棉 花黄萎病菌中。同时作为土传病害，利用木霉菌防治该病发生是一种重要的防治 方法之一。本研究即从以上两个方面着手进行了相关研究，并取得如下主要结果： 1．GFP基因在棉花黄萎病菌中的转化 首先对菌龄、裂解酶种类、酶解温度、时间和稳渗剂等方面进行研究，优化制 备棉花黄萎病菌原生质体的最佳条件，结果表明，在液体培养36h后，采用崩溃酶 +裂解酶+蜗牛酶的混合组合物，以0．7mol／L的NaCl作为渗透压稳定剂，在30C培养 条件下酶解2．5h，可获得最大原生质体制备量。 利用获得的原生质体，通过PEG介导法把含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表 达载体pSilem．EGFP转化进棉花黄萎病菌。每llag质粒DNA转化得到3—4个含GFP的 转化子。转化子经过连续继代培养9代仍能发出稳定而强烈的荧光，利用PCR扩增 转化子基因组DNA，获得-9pEGFP上GFP基因大小相同的片段，表明GFP基因已成 功转入棉花黄萎病菌基因组中且稳定遗传。再通过荧光检测分析，转化子菌株荧 光表达强烈，在菌丝，分生孢子梗以及分生孢子中都可观察到强烈的荧光，微菌 核由于受黑色素影响，只能在初形成时观察到较弱荧光。生物学性状研究表明， 转化子菌株生长，菌落形态、生长速度、菌丝颜色、产孢量以及孢子形态等与野 生菌株无明显差异。 2．木霉诱导抗性试验及拮抗木霉筛选 挑选了四株已在实验和生产中应用的生防木霉菌株NF9、TC3、TY、Pl，接种 灭菌麦粒，待产孢后，均匀撒于棉花种子周围，使其可在棉花根部定殖。在棉花 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 六至七真叶期，从茎部注射棉花黄萎病菌孢子悬浮液，接种十三天后观察各棉花 植株发病情况，进行抗病性评价。结果显示，与对照相比，种子经过木霉处理的 棉花对棉花黄萎病菌并无明显抗性。 进一步对本实验室分离到的57个木霉菌株(包括上述四株)进行了拮抗棉花黄 萎病菌的筛选。通过对峙培养发现，几乎所有菌株都没有筛选到有明显重寄生作 用的菌株。但通过玻璃纸培养法筛选到代谢物对棉花黄萎病菌的生长有明显抑制 作用的木霉菌株15株。 关键词：棉花黄萎病菌 绿色荧光蛋白 转化生物防治 2 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 Abstract Abstract Verticillium wilt，caused by Verticillium dahliae，is a widespread disease that occurs in most cotton-producing areas．矿dahliae is a soil—borne pathogen that infects plants through the roots，which is characterized by、析de distribution,severe damage，wide host range，many transmission approaches and long life．Usually,it Can generate variants if the environment changes．So，it’S difficult to control verticillium wilt．It will supply important base for controlling the disease to illustrate the infection process and elu