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探析分光光度法测定水中叶绿素a方法改进 【摘要】针对水中叶绿素含量测定步骤繁琐，操作 过程损失多，人为干扰因素大等特点，在不改变原有方法的 基础上，对叶绿素处理方式进行改进：用丙酮超低温冷冻萃 取；超声波充分震荡破碎混匀；微孔滤膜进一步过滤去除杂 质干扰。通过试验，发现新方法测定在很大程度降低了操作 过程中人为因素的耗损，提高了检测效率和检测质量。 【关键词】叶绿素a;分光光度法；醋酸纤维膜；丙酮; 微孔滤膜 1前言 随着现代经济的高度发展和人口膨胀，湖泊、水库正接 纳越来越多的氮、磷等营养负荷，也使得浮游生物及其他水 生生物异常繁殖，造成水体富营养化，严重影响供水水质。 藻类计数和叶绿素含量的测定是用于评价水体富营养化水 平的两大生物水质检测指标，利用显微镜对水中藻类计数耗 时长、检测人员存在主观判断差异不同，测得的藻类计数结 果往往相差较大。叶绿素测定受人为主观判断影响相对较 小，含量比较稳定，因此，成为评价水质富营养化水平的主 要水质指标。 2叶绿素测定新方法 本文是根据《中国湖泊富营养调查规范》、《水与废水标 准检验方法》第四版等资料提供的操作方法，在不改变原方 法的基础上，对含藻水样经过过滤浓缩、冷冻萃取、超声波 振动、再对离心后的水样进行再过滤，通过分光光度计测定 萃取液中叶绿素的浓度。通过反复试验，取得了较好的试验 结果。同原方法相比较，叶绿素测定含量提高了 11. 8%? 23. 3 %。 3实验原理和材料 1实验原理 分光光度法测定水中叶绿素含量的原理是以有机溶剂 丙酮溶液直接提取浮游生物浓缩样中的叶绿素，测定其吸光 度，根据叶绿素a在特定波长的吸收，用公式计算其含量。 3.2试剂 （1） 90%的丙酮溶液 （2） 1%的碳酸镆悬浊溶液 （3） 仪器设备及器皿 1） 过滤装置：过滤器，醋酸纤维滤膜（直径50mm，孔 径0. 45um）、真空泵 2） 台式医用离心机（最大转速4000r/min）、超声波仪、 微漩涡器 3） 器皿：研钵，微孔滤膜、镊子、剪子、塑料离心管、 10mL标准容量瓶 4测试方法的比较（方法II为改进方法，方法I为原有 方法) 叶绿素测试步骤为：浓缩_萃取_离心_分光光度 测定。两种方法的不同之处有以下两点： 1萃取冷冻不同 方法I:抽滤完毕后，用镊子小心去下滤膜放在培养皿 中，置于冰箱低温干燥6?8个小时后加入2?3mL90%的丙酮 研磨3?5min知道成液体状，倒入离心管中，反复冲洗研磨 器，直至研碎醋酸纤维滤膜完全转出。 方法II:抽滤完毕后，立即用剪刀将滤膜剪碎，置于 有螺帽的离心管中加入6?8mL 90%的丙酮浸泡，然后置于零 下20度的冰箱中冷冻6?8小时 4. 2震荡效果不同 这一步非常关键，方法1是纯手工搅拌，来保证滤膜和 丙酮完全混合达到离心萃取的目的。方法n则是利用微漩涡 器和超声波震荡的原理对装有混合物的离心管进行避光震 荡15min,萃取效果好。 5实验结果 (1)多次试验发现，方法I处理的叶绿素，在滤膜研 磨过程中，形成大量碎屑悬浮于提取液中。《水与废水标准 检验方法》第四版方法中要求OD750nm的吸光度不大于 0.005,如果离心后不能很好地沉淀分离，是必对测定结果 产生很大的影响，在0D750nm处的吸光度高，影响测定结果。 将醋酸纤维滤膜加入少量的碳酸镁悬乳液后，用蒸馏水 代替水样按方法II、方法I进行处理，结果如下： 从这个实验结果得出：而方法II正是通过微过滤来降低 浊度影响，起到了很好地控制作用。 (2)本文以董铺水库原水为例，测定叶绿素a含量， 通过多次调查研究实验，对2014年1月?2014年3月间五 组数据进行方法试验比对，结果如下： 6结果与讨论 从上表结果数据中得出： 方法I在离心后OD750的光密度仍高于0.005，有时迗 到0. 020。误差偏高，方法II0D750的光密度严格控制在0. 005 以下；这是由于采用了微孔滤膜过滤去除，处理效果达到了 《水与废水标准检验方法》第四版方法中要求OD750nm的吸 光度不大于0.005的要求。 (2)由于通风效果不好，研磨中高浓度丙酮溶液的挥 发对操作人员损害较大；方法II减少这一环节，降低人为 素产生的耗损，也减少试剂对人的伤害。 参考文献 [1]国家环保总局.水和废水监测分析方法(第四版)增 补版[M].中国环境科学出版社，2⑻8 [2]冯青英，唐怡，李丽容.地表水中浮游植物叶绿素a 提取方法的改进研究[J].安徽农业科学，2007 (31). 作者简介： 程真文（1968.02-），女，安徽合肥人，本科学历，工 程师，主要从事水质分析研究工作，包含生物、放射性、工 艺、无机和部分有机项目的检测和研究。