抗肺癌单链抗体融合人胸腺素α1的构建及表达-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文摘 浙江大学硕士学位论文 摘 要 胸腺素Ⅱl(Thymosin alpha 1，TⅡ1)是由28个氨基酸组成的酸性多肽，作 为免疫增强剂，其除具有免疫京q激效应外，还具有抗病毒及抗肿瘤功能。目前， 其广泛应用于非小细胞性肺癌、病毒性肝炎及免疫缺陷等重大疾病的临床治疗。 其分子量很小，只有3108D，故利用基因工程获取Ted单体显得很困难。迄今， 已有若干研究报道将Tal基因与具有特定生物学功能的效应分子进行融合表达， 如与谷胱甘肽、硫氧还蛋白及干扰素c【．2b等的融合，均取得较高效的表达结果。 抗肺癌单链抗体(LC一1 single．chain Fv，LC一1 ScFv)是对抗肺癌杂交瘤细胞 株(LC．1)分泌的单克隆抗体进行基因改造而获得的，是具有与抗原结合能力 的最小抗体片段。在抗体分子上连接细胞毒素、细胞因子或破坏细胞结构的酶、 药物及放射性同性素，可构建对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的复合物，后者统 称为免疫毒素或生物导弹。免疫毒素在早期肿瘤的诊断、治疗中具有重要作用， 同时也是手术、化疗后晚期癌症的有效治疗手段之一。有人将肿瘤坏死因子、绿 脓杆菌外毒素、白喉毒素与ScFv连接，用于肿瘤的导向治疗。本实验首次将完整 的抗肺癌单链抗体重组基因与Tal基因偶联，进行融合表达。获得表达的双功能 蛋白具有抗体的靶向性及Tetl的活性，既克服了Tal表达困难的缺点，又能借助 ScFv直达病灶的特性获得良好的治疗效果，为肺癌的治疗及检测探索了新途径。 本实验从高分泌量和活力较高的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株抽提总RNA， 并反转录成cDNA。设计引物，利用PCR获得单链抗体的重链和轻链基因，克隆 至qpUCm．T载体并测序。利用重叠延{申PCR法将重链和轻链基因构建为单链抗体 形式。修饰后的单链抗体与pET-22b(+)质粒连接，构建质粒pET22一ScFv。同时， 以重组质粒pET39．Tal为模板，PCR获得Tal基因，连接至lJpUCm—T载体上。对质 粒pET22一ScFv、口UCm—T．Tctl双酶切，回收相应片段，将Tctl连接至OScFv的C端， 构建ScFv．Tctl重组体，并转化大肠杆菌BL21，进行融合表达。在最佳表达条件 (30。C，IPTG浓度0．5mmol／L，诱导表达5h)下，外源基因产物表达量占全菌蛋 白的30％左右。 关键词：抗肺癌单链抗体；胸腺素d1；原核表达 堕竖奎兰里主兰些丝苎 Abstract Thymosin ctl，a 28一amino—acid peptide，is widely used in the diagnosis and treatment ofhepatitis B，hepatitis C，tumors，immune—deficiency syndrome．et df． Many researches attest to the interest paid to its fusion protein with other active factor such GS T’thioredoxin and IFN U一2b． LC一1 single—chain Fv(LC一1 ScFv)is monoclonal antibody obtained from the secretion ofLC-1，which was later constructed based recombinant phage displayed techniques．ScFv is the smallest segment being able to interact with antigen．Because ofits small molecular weight and lack ofFc，it has a stronger force ofpenetration and immunogenecity than conventional antigen．To date，the expression of fusion protein between Tal and ScFv has not been reported．In theory,this fusion protein should has both ofthe activity ofTal and antibody．The fusion protein Can be used for the monitoring and treating oflung cancer，and be apllied to the research ofthe acceptor ofcertain cell factor． The total RN