利用转基因体细胞核移植生产转基因绵羊相关技术研究-动物遗传育种与繁殖学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可咀用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 摘要本文系统地研究了利用体细胞克隆技术来生产转基因绵羊的几个主要技术环节，以便建立转 摘要 本文系统地研究了利用体细胞克隆技术来生产转基因绵羊的几个主要技术环节，以便建立转 基因和核移植操作程序．主要内容包括转基因细胞系的建立、激活、融合参数的优化以及供体核 和受体细胞质对核移植胚胎发育的影响。 首先从3个30日龄绵羊胎儿分离出成纤维细胞，经过体外培养．建立了SFFI、SFF2和SFF3 细胞系。胎儿成纤维细胞有生长快、数量多、传代多等特点。染色体倍性检测表明，前20代没有 明显变化，染色体倍性正常率均在70％以上．选用报告基因GFP转染胎儿成纤维细胞．优化电穿 孔法和磷酸钙沉淀法的转染条件。电穿孔法最佳转染条件为：采用场强1．25kV／cm。脉冲时程15ms， 电导介质为Dhanks，DNA用量为4“g／ml。对数期细胞密度为10L10 7个／ml，电击后在4C下分别 静放10min．能获得最佳转染效果。磷酸钙沉淀法最佳转染条件为：2HBS溶液最佳的PH为6．9-7．I， 在37(2下，加入6．4119／ml DNA，甘油休克7分钟，转染24小时．克隆株数最多，效果最佳。采 用电穿孔法成功地敲除Myostatin，以转染时的细胞数来计算转染率约为1矿，形成纯合子概率约 为1．5×10‘8。 在孤雌激活方面，采用电脉冲时程为80ps，场强为1．2kvlcm能有效激活卵母细胞；在5．0 u M离子霉索内处理5分钟，能获得最佳的激活效果．激活率为90．9％；在7％乙醇内处理7分钟 可达到最大激活率91．8％。实验发现，离子霉素和电脉冲对绵羊卵母细胞激活较乙醇更为有效。 为了探索核移植技术中电融合参数，对绵羊2期胞胚胎的融合进行了研究，在脉冲时程40u s-150 u S，场强为2．2kv／cm下，能有效地融合绵羊2．细胞胚胎细胞，可获得70．4％-77．1％融合率。为 了克服绵羊8-16细胞胚胎发育的阻断，采用KSOM作为发育液效果好于SOF；在不同阶段使用 含有不同蛋白质的发育液．超过16-细胞的胚胎百分率为46．1％，高于单独使用一种蛋白质，它们 差异显著(p如．05)；添加IOng／mIF．OF和50 u mol／mL牛磺酸能显著提高超过16细胞胚胎发育率， 可达62．6％。 受体卵母细胞和供体核的准备是核移植成功的关键。在受体方面，卵龄为18—20小时，去核 率晟高，可达71．6％；用经产母羊卵母细胞为受体好于用育成羊卵母细胞为受体细胞，前者的重 构胚囊胚率为15．7％．后者重构胚囊胚率为2．9％．二者差异显著(P0．05)；季节对核移植的影 响也是不容忽视的，繁殖季节重构胚囊胚发育率(13．8％)明显高于非繁殖季节重构胚囊胚发育 率(4．7％)．二者差异显著(PO．05)。在供体方面．用5．7代细胞作供体核，桑椹，囊胚率高于16-18 代的桑椹债胚率，二者差异显著(Po．05)；直径为20-25 u m细胞作供体核，桑树囊胚率可迭 20．0％，而直径为10-15 It m细胞作供核，桑椹壤胚率可达8．0％，但二者差异不显著(P0．05)； 血清饥饿与非血清饥饿的细胞做供体核，桑椹胚I囊胚发育率没有显著差异；用0．05 u M秋水仙素 处理供体细胞效果最好，桑椹，囊胚率可达35．0％，而未处理或用0．1 u M秋水仙索处理供体细胞， 桑椹壤胚率分别为17．1％和12．1％，它们与0．05 u M处理差异显著(P0．05)，可见．0．05 u M秋 水仙素是最佳处理浓度；以GFP转基因细胞系作为供体，获得81个重构胚，没有得到囊胚。 综上所述，我们基本上建立了生产转基因克隆胚胎的实验操作程序，获得了各个环节的技术 参数，但效率低下，重构胚发育能力弱，仍需进一步丈量的研究。 关键词：绵羊