利用组织芯片和蛋白质组学技术分析和探讨乳腺癌耐药和转移的相关性-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中文摘要目的： 中文摘要 目的： 多药耐药和转移的发生是临床上肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因．尽管 在过去几十年中对恶性肿瘤的这两种特性已经进行了广泛研究，但是大多数只 是把其做为两种单独的生物学行为进行研究．近来越来越多的证据表明这两种 表型之间存在着一种功能上的联系：首先是从亲本细胞中筛选出来的耐药细胞 系具有更强的侵袭和转移能力，此外对一些转移性肿瘤的研究发现转移灶细胞 比原发瘤的耐药性明显增强，而这与临床上所观察到的发生转移的肿瘤患者化 疗效果较差以及化疗效果不好的肿瘤患者容易出现转移的结果相一致．因此， 这种肿瘤细胞耐药可以增强其转移能力和转移能力较强的肿瘤细胞表现出更强 的耐药现象表明，在肿瘤的进展过程当中，耐药和转移的进展可能不是单独发 生的，两者之间可能存在一种功能上的联系。因此，对肿瘤细胞耐药和转移相 关性的正确理解可以导致更有效的肿瘤治疗。 由于肿瘤的多药耐药和侵袭转移是异质性的，不同的肿瘤的耐药和转移机制 不同，耐药和转移的发生是多个基因多个通路表达的结果；而传统的研究方法 只研究某一独立的生化传导通路、基因或蛋白质，这样的方法用来研究复杂的 肿瘤多药耐药性和转移显然是不全面的；因此，有必要采用能够获得全面生物 学信息的研究工具，进而可以全面完整的获取肿瘤细胞耐药和转移相关的生化 传导通路，使我们更加深人的理解肿瘤耐药和转移的作用机制，探索新的治疗 耐药肿瘤的作用靶点． 基于此，本研究采用组织芯片和蛋白组学的高通量研究技术来分析和探讨乳 腺癌耐药和转移的相关性，并筛选和鉴定乳腺癌耐药和转移相关蛋白质，以揭 示乳腺癌多药耐药与转移发生之间的相关分子机制。 方法： 第一部分： l，以人乳腺癌细胞系MCF．7和由阿霉素诱导的耐药株MCF．7／ADR为模型，采用 l，以人乳腺癌细胞系MCF．7和由阿霉素诱导的耐药株MCF．7／ADR为模型，采用 免疫细胞化学和RT-PCR等方法研究乳腺癌多药耐药细胞MCF一7／ADR中 Twist的表达与EMT现象之间的相关性； 2、采用组织芯片技术检测乳腺癌组织耐药相关蛋白MDRl，MRP、LRP和GST- 丌以及肿瘤转移相关因子MMP2、MMP9和MMPl3的表达以初步分析肿瘤耐 药和转移之间的相关性． 第二部分： l、人乳腺癌细胞系MCF·7和由阿霉素诱导的耐药株MCF-7／ADR为模型，分别提 取两种细胞总蛋白，通过双向凝胶电泳分离，第一向采取固相pH梯度等电聚 焦电泳，第二向采用SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后进行硝酸银和考马斯亮 蓝染色．通过h11ageMas衙双向电泳图像分析软件对2DE图谱进行数字化分析 匹配与对比，寻找差异表达蛋白质。 2，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MADI-TOF／MS)技术对差异蛋 白进行肤质量指纹图谱解析，获取差异蛋白点肽指纹图谱(PMF)． 3、应用生物信息学的方法进行数据库搜索，初步鉴定差异蛋白质，并对蛋白质 的功能进行初步分析。 结果： 第一部分： 1．亲本细胞MCF·7中F_,-cadherinmR_NA的表达和蛋白水平的表达均为阳性， Twist和N-cadherin表达阴性；多药耐药株McF-7／ADR中E—cad_herin mRNA和 蛋白表达缺失，而在亲本细胞MCF·7中不表达的Twist和N-cadheria则表达阳 性 2、乳腺癌组织*MDm和LRP的表达与淋巴结状态密切相关(p值均小于0．05)： 乳腺癌组织中基质金属蛋白酶MMP一2、MMP一9的表达与肿瘤大小有关(p值均 小于0．05)，与临床TNM分期和淋巴结转移状态密切相关(p均o．01)；乳腺癌 lI 中M／rIP-13的表达与临床TNM分期，淋巴结转移状态密切相关Q均o．oi)。 中M／rIP-13的表达与临床TNM分期，淋巴结转移状态密切相关Q均o．oi)。 3，MRP的表达与MMP9的表达呈高度正相关(P=0．004)；MDRI的表达与MMP9 的表达呈高度正相关，(P=O．000)；MDRI的表达与MMPl3的表达呈高度正 相关(P；O．001)；LRP的表达与MMP2的表达呈现高度正相关(P=0．001)； 第二部分： l，初步建立和优化了双向电泳技术，并获得了比较清晰的电泳图谱．图像分析 显示两种细胞来源的双向凝胶电泳图谱非常相似，蛋白点位置重复性较好。 乳腺癌细胞MCF-7细胞2D图谱可识别的点为868±25，MCF．7／ADR为879± 19．以MCF一7双向凝胶电泳图谱作为参考胶，MCF-7／ADR中平均匹配蛋白点 为777个，蛋白点匹配率为89．6％． 2、MCF一7和MCF一7／ADP,细胞中一共发现有67个差异蛋白点，其中在MCF一7中特 异表达上调的有46个；在MCF-7，ADR中特异表达上调的21个。另外一共有