新敏荧光试剂合成与其在高效液相色谱中的应用.pdf

第一章荧光标记及其在高效液相色谱中的应用进展 1．前言 色谱法又叫色层法或层析法，是20世纪初发展起来的一种分离分析方法。色谱分析 谱(HPLC)更是如此，据估计世界上几百万种化合物中除20％宜用气相色谱分离分析外， 其余80％的化合物，包括大(高)分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生 物活性的化合物，需要用高效液相色谱进行分离分析【l】。将HPLC引入生物技术领域，对 生物工程已造成深远的影响，特别是对氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维 生素、抗生素等生物活性物质的分离分析，有着其他分析方法不可替代的作用【2】。目前， HPLC已广泛应用于生物化学、医药工业、临床医学、食品卫生、商品检验、环境监测、 石油化工、油田开发、地质勘探等领域的分离分析。 现在，高效液相色谱仪中还没有一种通用型检测器。相比与其他检测器，荧光检测器 要灵敏得多，而且它对温度变化不敏感，宜于梯度洗脱。因此使用配备荧光检测器的液相 色谱仪可以满足人们由常规分析转向痕量及超痕量分析的要求。但这就要求被测样品能被 激发产生荧光。然而现实中大多数的物质不发荧光或荧光较弱，为了扩大荧光检测的范围， 提高检测灵敏度，采用化学衍生法成为一个行之有效的途径。目前，液相色谱领域中的衍 生化试剂种类繁多，但在实际应用中都存在着这样或那样的缺点，如：对有机酸化合物的 荧光标记试剂主要有重氮甲烷类和香豆素类，重氮甲烷类试剂虽然衍生条件温和不需催化 剂，但试剂非常不稳定；香豆素类试剂衍生反应需要在相转移催化剂18．冠．6的存在下进 行，衍生试剂对水和光不稳定，流动相的变化影响衍生物的荧光量子效率。对胺类化合物 衍生试剂中，FMOC．C1衍生化后需要经过萃取处理消除过量试剂的干扰，操作过程繁琐且 易造成疏水衍生物的丢失；OPA虽然灵敏度高，但衍生物易分解，分离重现性差：AQC 是近年来最为广泛应用的胺类化合物衍生试剂之一，但试剂在水相体系内的荧光量子效率 低，不利于梯度洗脱，换句话说，首先被洗脱出的衍生物灵敏度不理想。因此，为提高灵 敏度和选择性以及扩大应用范围而进行的开发新的荧光试剂是一个活跃的研究领域，继续 开发能够满足实际需要的高灵敏荧光标记试剂仍然具有重要意义。 为提高检测灵敏度、满足对痕量和超痕量组分高灵敏检测的要求，30多年来已经报导 许多种荧光标记试剂，在应用中各具特色。表1．1列出了一些近年来常用的荧光标记化试 剂，并将试剂的应用对象和衍生物的结构式附在其后。 表1．1常用荧光标记试剂及其适用对象 适用的 化合物 ＼ 标记试剂 化合物 衍生物 1．二甲氨基萘．5．磺酰 叭／～ RNH2，RR’NH， ≯ 氨基酸， 、产 一 氯(丹酰氯，Dns—C1) 囱 R-CN， 向 }叩 At-OH[3】 ko—景 邻苯二甲醛(OPA) 氨基酸， 芘 多肽【41 口吊 O 芴甲氧 H FH’oC刁 ，P—o槲P删 羰基氯 氨基酸 蝴知 (FMOC—c0 哟 15q N．a．9．芴甲氧基碳酰 ．氨基酸基-N．羧酸酐 呖 手性分离氨基酸f71 ％庐吖、 芴甲氧碳酰基甘胺酰 凡k 手性分离氨基酸【gJ ，广州～节 象～ 幽a