六个小麦条锈病菌诱导的UniGene表达特性分析及TaLHY和TaNIT基因的克隆-生物物理学专业论文.docxVIP

唰唰州 。。恻 唰唰州 。。 恻肌肌肉U 阳川川咱 ， 川川川hu 唰川n川υ 州川川00 刚刚川W吨A ， 阳 Y 论文独创性声明 本人郑童声明:所里交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标柱和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一问工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 飞俨系、去乡。1。J，e 飞 俨 系、 去乡。1 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留并向国家有 关部门成机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的余部成部分内容。 户[v 年 j 月叫 决矿l lJ 年 6 月Jd-- 日 摘要 条锈病(Pucciniα striiformis f 再p.tritic) 是我国小麦的主要病害，特别是在我国西部 地区由于适宜的发病条件，使条锈病近年来成为该小麦生态区最严重的病害。条锈 菌生理小种变异快，条锈病抗源匮乏，可利用的抗性基因较少和条锈病原菌与寄主 植物1工作及植物抗病机理复杂，分子机理尚不清楚是限制了抗条锈病新品种的培育 的原因。因此，在不断地发现新的抗性基因，快速培育具有持久抗性的突破性小麦 新品种的问时，加强条锈病原菌与寄1:识别及植物抗病的分子机理研究，克隆抗条 锈病及其相关基因，是推动从根本上解决小麦条锈病威胁的关键。 本研究在已经构建的小麦条锈菌条中 32 (CY32) 诱导的抗条锈病品种川农 19 (CN19) 的拥制差减杂交 (SSHcDNA) 文库、并获得了大量差异表达 ESTs 的基 础上，从中挑选出 6 个抗病相关的 UniGene 进行了表达特性分析，利用队 CE 技术 和电子克降技术对其中的 2 个基因进行全长克隆研究，以期从转录水平探讨条锈菌 诱导的抗病反应分子机理和发掘抗条锈病相关基因。研究结果如 r: 1 应用半定量 RT-PCR 技术对 SSHcDNA 文库中筛选的 6 个抗病相关的 UniGene 在不同组织、病原菌诱导、激素处理和非生物胁迫条件下进行表达特性分 析。 6 个 UniGene 巳绕在文库筛选过程中功能注释分别为 VTC2 ，SAMDC，SHM飞 半乳糖结合凝集素， JIP 和 LHY 蛋白。①组织特异性表达分析结果表明， 6 个 UniGene 均能在拔节期的根、菜、叶及穗，和苗期的根和叶中表达，其中在穗或根中表达水 平相对较高;@病原菌诱导表达结果表明， 6 个 UniGene 对条锈菌和白粉菌诱导的 应答反应模式不间。 CN19 在接种 CY32 后， 6 个 UniGene 皆能在 24-48 小时内被诱 导表达，积累到比较高的水平，而白粉病菌浸染后仅有半乳糖结合凝集索、 VTC2 和 JIP 基因在接种 48 小时后开始表达，在 96 小时达到高峰。推测 SAMDC 、SHMT 及 LHY 基因是小麦条锈菌 (CY32) 诱辱的高丰度表达基因:③激素诱导表达分析 表明， 6 个 UniGene 皆对应答乙烯 (Et) 产生应答反应，而对 SA 和 ABA 产生不同 的应答反应，推测 CN19 与 CY32 不亲和互作反应主要通过 EtJJA 途径调控， SA 与 ABA 对防御反应中的部分基因具有调控作用:④ JIP、植物凝集索基因和SHMT 也参 与冷、干早和南盐非生物胁迫的应答反应。 2 TaLHY 基囚的克降与生物信息学分析:从构建的 SSIιcDNA 文库中，利用 RACE-PCR 技术克隆了一个小麦 MYB 转录因子一-TaLHY 基因。其 cDNA 全长 11 11 3085坤，其开放阅读框为 1947坤，推测编码蛋白为 648 个氨基酸，分子量为 70.3kD队 等电点为 6.34; 具有一个典型的植物 MYB-DNA 结合结构域，在结构域的 C-端具 有十分保守的氨基酸序列 SH[AL]QKY[盯]，与其他已公布的 LHY 家族成员具有较 高的序列一致性，首次在小麦中报道了 LHY 蛋白，亚细胞定位分析 TaLHY 蛋白定 位于细胞核，参与基囚的转录调控、转录、信号转导功能。 TaLHY 基因能在条锈菌 诱导 48 小时后表达水平提高，同时在日处理 1 小时和 4小时表达水平提高，证明 了该基因参与小麦抗条锈病防御反应相关，问时，该基因参与防御反应可能是通过 JA?t 途径调控。 3 目的基因TaNn克陆与生物信息学分析:利用