淋病奈瑟菌PorB蛋白原核表达载体的构建及其活性测定-病原生物学专业论文.docxVIP

Y Y 60526C 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：7击象曾 日期：扣牛年f月：7日 关于学位论文使用授权说明 本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论 文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文； 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名：氍春兽 导师签名：详缸奎日期：护仁年r月z，7日 陆春雪 陆春雪 南华大学硕J二学位论文 淋病奈瑟菌PorB蛋白原核表达载体 的构建及其活性测定 研究生：陆春雪 导师：谭立志教授 中 文摘要 目的：PCR体外扩增淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的编码基因，克隆至pUC,-T载 体，并对扩增的序列进行分析；构建外膜蛋白PorB的原核表达载体，在大肠杆 菌中诱导表达，分别于天然和变性条件下纯化表达产物6His—PorB融合蛋白： 检测6His—PorB融合蛋白的免疫活性及其致Hela细胞凋亡活性。 方法：本实验首先通过对GenBank收录的PorB蛋白编码基因进行分析，然后 自行设计引物扩增淋病奈瑟菌WHO标准株E株PorB蛋白的编码基因。将PCR 产物回收，克隆到pUC。-T载体，转化大肠杆菌JMl09，蓝白筛选挑取阳性重组 子进行限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定，并对测序结果用Blast软件进行 分析。限制性内切酶双酶切克隆质粒pUC。--T／porB和原核表达载体pQE30，将 目的基因porB定向克隆到表达载体上，用通用引物测序，获得未发生移码突变 的pQE30／porB融合载体质粒。转化入大肠杆菌M15后，用0．2mMIPTG，30 4C诱 导表达融合蛋白6His-PorB，用Ni—NTA Spin kit对上清和沉淀中的融合蛋白 分别于天然和变性两种条件进行纯化，SDS—PAGE和Western blot鉴定表达和 纯化产物。 人宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)培养于含lO％d,牛血清的RPMIl640完全 培养基中。当细胞贴壁生长至75％-90％融合时，收集细胞，用培养液调整细胞 数为2×106／mL，处理组细胞加入终浓度为7 u g／mL的天然条件下纯化的融合蛋 白，对照组加入相同体积的PBS，作用15h后，用FITC—Annexin V和PI对两 组细胞进行标记，于荧光显微镜下观察Hela细胞的凋亡情况。 陆春雪 陆春雪 南华大学硕J二学位论文 取6--8周龄普通级雄性昆明小鼠20只，随机分为免疫组和正常组两组， 免疫组用变性条件下分离纯化、复性后的融合蛋白40 u g与完全福氏佐剂混合 并充分乳化后，皮下多点注射法免疫小鼠，正常组用无抗原的完全福氏佐剂免 疫，共免疫三次。术次免疫7天后，眼球摘除法取血，分离血清，并于无菌条 件下取脾淋巴细胞培养；ELISA检测两组血清的PorB抗体滴度及阳性反应率， MTr比色法检测脾淋巴细胞的转化。 结果：PCR法扩增获得淋病奈瑟菌WHO标准株E株PorB蛋白编码基因，将 其插入pUC。．T载体中，经序列测定分析，证实与GenBank公布的序列同源性 高达99％；BamH I和HindIII双酶切克隆质粒pUC。一T／porB，回收目的基因porB 亚克隆至原核表达载体pQE30，酶切、PCR和测序鉴定结果表明，插入的序列 与原PCR扩增序列完全相符；转入大肠杆菌M15后，用IPTG诱导重组融合蛋 白6His．PorB表达，诱导6小时后蛋白表达量最高，且在上清和沉淀中均有存 在，经Ni．NTASpinKit镍离子亲和纯化获得了两种不同存在形式的纯化蛋白； Western blot印迹法鉴定，在34KD位置有特异条带，与预期融合蛋白大小一 致。天然条件下纯化的融合蛋白与Hela细胞共孵育15h后，可诱导Hela细胞 出现明显的早期凋亡改变；蛋白免疫组小鼠的淋巴细胞经表达蛋白刺激后，转 化率为0．41±0．03，显著高于正常组的0．15±0．01(P0．01)：免疫组血清中 PorB抗体的效价达1：640，血清阳性率为8／10，而正常组血清中则无特异性 抗体存在。 结论：1、成功构建了pQE30／porB原核表达载体，将其转化大肠杆菌后能分别 以可溶性形式和包涵体形式两种方式表达重组融合蛋白6His—PorB； 2、以可溶性形式表达的融合蛋白经天然条件下纯化后，具有生物学活性，能够 诱导Hela细胞出现早期凋亡； 3、以包涵体形式表达的融