快速耳蜗损伤小鼠模型的建立及应用-耳鼻咽喉-头颈外科学专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 快速耳蜗损伤小鼠模型的建立及应用 华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科 博士研究生：熊浩 导师：褚汉启教授 中文摘要 第一部分 两种小鼠耳蜗损伤方法的比较 目的： 比较两种小鼠耳蜗损伤方法的效果。 方法： 采用两种不同的方法损伤 CBA/J 小鼠耳蜗。第一种方案：卡那霉素 700mg/kg， 皮下注射，每日 2 次，连续 14 日。第二种方案：卡那霉素 1000mg/kg，皮下注射，30-45 min 后呋塞米 400mg/kg，腹腔注射。在给药前、给药结束后 1 天 (d1) 及给药结束后 7 天 (d7) 应用听性脑干反应 (auditory brainstem response, ABR) 评估小鼠听觉功能改 变；在 d7 应用琥珀酸脱氢酶 (succinate dehydrogenase, SDH) 染色评价毛细胞 (hair cells, HCs) 线粒体功能损伤情况。 结果： CBA/J 小鼠在单独应用卡那霉素后，ABR 阈值在 d1 明显升高，随后在 d7 继续升 高。形态学结果显示耳蜗底回绝大部分外毛细胞 (outer hair cells, OHCs) SDH 活性消 失，而内毛细胞 (inner hair cells, IHCs) SDH 活性保存完好；顶回部分 OHCs SDH 活 性减弱，而 IHCs SDH 活性绝大部分保存完好。CBA/J 小鼠在联合应用卡那霉素及呋 塞米后，ABR 阈值同样在 d1 明显升高，在 d7 继续升高，且最终阈移大于单独应用卡 那霉素之阈移。形态学结果显示耳蜗底回及顶回 OHCs SDH 活性完全消失，而 IHCs SDH 活性保存完好。 结论： 两种方法均能造成小鼠耳蜗损伤，但联合应用卡那霉素及呋塞米较单独应用卡那 霉素对耳蜗损伤程度更大，且操作更简便。 关键词： 卡那霉素；呋塞米；耳蜗；小鼠 第二部分 联合应用卡那霉素和呋塞米快速诱导小鼠耳蜗损伤 目的： 探讨卡那霉素和呋塞米联合应用对小鼠耳蜗的毒性作用，建立一种可靠的小鼠感 音神经性聋模型。 方法： 选用 3-4 周龄的 CBA/J 小鼠为实验对象，按 1000mg/kg 的剂量皮下注射卡那霉素， 30-45 min 后按 400mg/kg 的剂量腹腔注射呋塞米。在注射前、注射后 12 小时 (d0.5)、 1 天 (d1)、2 天 (d2)、7 天 (d7)、14 天 (d14)、28 天 (d28)及 112 天 (d112)分别应用 听性脑干反应 (auditory brainstem response, ABR) 检测小鼠听觉功能的改变；应用异 硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽及碘化丙锭染色、半薄切片甲苯胺蓝染色、脱氧核苷酸 末端转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记 (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL) 技术、扫描电镜等观察小鼠毛细胞 (hair cells, HCs) 和螺旋 神经节细胞 (spiral ganglion neurons, SGNs) 死亡的模式和程度。 结果： 小鼠 ABR 阈值在 d0.5 开始上升，随后至 d2 期间继续进行性上升，继而趋于稳定 在 90 dB SPL 左右。应用激光共聚焦显微镜在 d0.5 观察到耳蜗底回外毛细胞 (outer hair cells, OHCs) 开始出现死亡，d1 时底回 OHCs 基本全部消失，同时顶回 OHCs 开始出 现死亡，至 d2 时整个耳蜗 OHCs 绝大部分死亡；而内毛细胞 (inner hair cells, IHCs) 的 损伤至 d7 时才开始出现，随时间推移仍有部分 IHCs 完好无损。TUNEL 结果显示死 亡的 HCs 均具有典型的凋亡细胞特征。扫描电镜显示卡那霉素和呋塞米联合应用后 HCs 首先出现纤毛消失，表皮板塌陷，随后支持细胞增生并在该处形成瘢痕。SGNs 在 d2 保持完整，但在 d7 开始出现体积减小，d14 天出现数量减少，至 d28 大部分死 亡，至 d112 仅余少数细胞残留。 结论： 单剂量序贯应用卡那霉素及呋塞米能快速诱导小鼠耳蜗 HCs 大量死亡，并能造成 SGNs 延迟性死亡，适用于建立小鼠感音神经性聋模型。 关键词： 卡那霉素；呋塞米；耳蜗；小鼠 第三部分 小鼠耳蜗外侧壁在感音神经性聋发生后的反应 目的: 探讨感音神经性聋发生后小鼠耳蜗外侧壁形态和功能的改变。 方法: 选用 3-4 周龄的 CBA/J 小鼠为实验对象，联合应用卡那霉素及呋塞米致聋。在给 药后 12 小时 (d0.5