人参皂苷Rb1对高糖培养海马神经元胰岛素信号转导途径影响.docxVIP

人参皂昔Rbl对髙糖培养海马神经元胰岛素 信号转导途径影响 ［摘要］目的：探讨人参皂昔Rbl对髙糖培养SD大 鼠海马神经元糖原合成激酶（GSK） 3B/胰岛素降解酶（IDE） 信号转导通路及B淀粉样蛋白（AB蛋白）分泌的影响。方 法：原代培养新生24 h SD大鼠海马神经元分别接种在不同 条件的培养基中，分为正常组、高糖组、氯化锂组以及Rbl 组。上述培养基中培养72 h, Western blotting法检测其 磷酸化 GSK3B （pGSK3B）、总 GSK3 0 （tGSK3B ）和 IDE 蛋 白的表达，RT-PCR法检测GSK3B, IDE mRNA的表达，ELISA 法检测细胞上清液中AB蛋白的分泌。结果：与正常组相比, 高糖组p/tGSK3 B蛋白比值增加，IDE蛋白及mRNA减少，A B 蛋白分泌增加（P99%）,用前以DMEM培养基配制储存液；DMEM 高糖培养基、优质胎牛血清（FBS）、0. 25%胰蛋白酶 +0. 03%EDTA均购于北京协和细胞资源中心；多聚右旋赖氨酸 （PDL）购于美国Sigma公司；兔抗鼠pGSK3 B，tGSK3 B， IDE多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；AB 42 ELISA试 剂盒购于美国BD公司。 DMEM完全培养基的配制：DMEM高糖培养基（180 mL） 中分别加入FBS （终浓度10%）, Hepes （20 mmol ? L-1）,丙 酮酸钠（1 mmol ? L~1）,双抗（青霉素100 U ? mL-1,链霉 素100 mg ? L-l）,谷氨酰胺（2 mmol ? LT ）,神经生长因子 （nerve growth factor, NGF） （10 y g ? L~1 ）□ 4 °C冰箱 保存备用。 3仪器3111C02培养箱（美国Forma）； PK121R高速 低温离心机（意大利ALC）；MultiSkan3酶标仪（美国Thermo）； IX71-A12FL倒置相差荧光显微镜（日本0lympus）； CKX31SF 倒置相差显微镜（日本0lympus）； TCS SP2SE激光扫描共聚 焦显微镜（日本LEICA）o 2方法 2.1海马神经元的分离、纯化与培养具体步骤见文献 [5],最后接种于0. 01%PDL包被的培养瓶或培养板中。 2海马神经元的鉴定以5X105个/孔的浓度将细胞 接种到放有盖玻片的6孔培养板中培养，第3天取出盖玻片 行神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE） 免疫荧光鉴定，激光共聚焦显微镜检测NSE的表达情况。具 体步骤：用0. 01 mol ? L-1PBS浸洗盖玻片，后加入4 9预 冷的4%多聚甲醛常温固定1 h； 0.01 mol ? L-lPBS漂洗3次 X2 min,在每个盖玻片加入20 uL 0. l%Triton~X100后常 温孵育 10 min； 0. 01 mol ? L-1PBS 清洗 3 次X2 min,然后 加入山羊血清封闭液，结合非特异性蛋白，室温孵育20 min； 每个盖玻片加入20 uL 1 : 10稀释的兔抗鼠NSE多克隆抗 体，4 °C过夜，阴性对照组则以0. 01 mol - L-l PBS代替一 抗；0. 01 mol ? L-1PBS清洗3次X5 min,然后在每个盖玻 片加入20 uL 1 : 50稀释的FITC偶联山羊抗兔IgG，湿盒 避光 37 °C孵育 1 h； 0.01 mol ? L-l PBS 振洗 6 次X5 min, 每个盖玻片加入DAPI工作液常温孵育5 min,湿盒避光保存; 使用共聚焦激光显微镜检测，Leica Confocal图像分析软件 分析图像，3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为 神经元纯度。 2.3分组使用DMEM完全培养基培养 海马神经元至第3天时，更换为不同条件的培养基，分为4 组：正常组、高糖组、氯化锂组和Rbl组。正常组采用完全 培养基培养（含25 mmol ? L-1葡萄糖），其余均加50 mmol ? L-1葡萄糖。氯化锂组另加1 mmol ? L-1氯化锂，Rbl组 另加1 nmol - L-1人参皂昔Rbl。 2. 4 Western blotting 法检测神经元内 pGSK3 B , tGSK3B及IDE蛋白表达水平 将细胞悬液接种到预先用PDL 包被的T25瓶中，细胞密度1.5X106个/瓶，6 mL/瓶。待 细胞生长至第3天，更换不同条件的培养基。继续培养72 h 后，除去培养基，收集细胞。200 P L/孔RIPA裂解液裂解 细胞。利用伯乐公司的Bio-Rad DC Protein Assay Kit 1 （Catalog： 5000-111）试剂盒测定蛋白浓度。电泳，转膜