课件：组化三酶组化.pptVIP

（3）染色步骤： ①新鲜组织，冰冻切片； ②固定：冷丙酮或10％福尔马林固定20~25分钟； ③蒸馏水洗； ④入孵育液,室温或37℃，恒温孵育1~2小时； ⑤蒸馏水洗； ⑥甘油明胶封固。 (4)结果与评价：乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位均显示棕色（红褐色）沉淀。 (5)对照：用四异丙基焦磷酰胺（ISO－OMPA）4mM(0.137%)0.2ml抑制非特异性胆碱酯酶酶而显示乙酰胆碱酯酶(AchE)。用毒扁豆碱硫酸酯(eserine sulfate)3×10－5M代替蒸馏水，将切片处理30分钟，水洗后再入孵育液内，则两种酶均被抑制而呈阴性。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 ５ˊ－核苷酸酶是一种特异性的磷酸单酯酶，它能水解核糖核苷和去氧核糖核苷在Ｃ－5位置的磷酸酯，如一磷酸腺苷（ＡＭＰ），一磷酸肌苷（ＩＭＰ），尿苷－磷酸（UMP）,胞苷－磷酸（ＣＭＰ）等，水解产生核苷和磷酸，但不能分解?－甘油磷酸，葡萄糖－６－磷酸。５ˊ－核苷酸酶是一种最适pＨ值相当广泛的酶。 （二）反应原理 底物经酶水解，用金属离子捕捉生成的磷酸离子而形成沉淀。即：腺苷－５ˊ－磷酸＋水 腺苷＋磷酸。 （三）光镜显示方法 铅法（Wachs和Meisel 1956） （1）?取材：新鲜组织冰冻切片 （2）?孵育液的配制： 腺苷－５ˊ－磷酸钠 4mg 0.2M Tris-苹果酸缓冲液 （Tris-maleate buffer）pＨ7.4 4ml 0.1M MgSO4(2.5%） 1ml 2%硝酸铅 0.6ml 蒸馏水 0.4ml （1）方法与步骤： ① 新鲜组织冰冻切片,或冷10%福尔马林 固定冰冻切片; ② 蒸馏水水洗; ③ 入孵育液,恒温37℃,孵育20~60分钟; ④ 自来水洗; ⑤ 入1%硫化铵1分钟; ⑥ 蒸馏水冲洗; ⑦甘油明胶封固。 (4)结果与评价: 棕黑色硫化铅沉淀为酶活性所在部位。 (5)对照: 可除去底物,或以?－甘油磷酸钠代替底 物,或加入碱性磷酸酶抑制剂溴化四唑草 酸盐可防止杂入的碱性磷酸酶起作用。 四、 葡萄糖－6－磷酸酶 (一)名称 常用名: 葡萄糖－6－磷酸酶（Glucose-6- phosphatase Phosphohydro- lase） 葡萄糖－6－磷酸酶是一种催化多种磷酸化合物水解的磷酸酶。例如它可以最快的速度催化葡萄糖－6－磷酸水解,也可以水解阿洛糖-6-磷酸、1,5-山梨醇聚糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、核酸－5－磷酸及2-甘油磷酸,同时此酶还可水解焦磷酸、核苷三磷酸,果糖-6-磷酸、氨甲酰基-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、磷酰胺盐和某些其它焦磷酸化合物。 （二）光镜显示方法 铅法（Wachstei和Meisel 1956） （1）原理：葡萄糖－6－磷酸被释放出磷酸后，为硝酸铅所捕获，最终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。 （2）孵育液的配制： 0.125%葡萄糖－6－磷酸钠 4ml 0.2M Tris-苹果酸（Tris-Moleate） 缓冲液pＨ6 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 蒸馏水 1.4ml 新鲜配制,充分混合后使用。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 （1）方法与步骤： ① 新鲜组织,冰冻切片, ② 3%冷福尔马林固定5分钟; ③ 水洗； ④ 入孵育液,恒温37℃,孵育5～20分钟; ⑤ 水洗； ⑥ 入1%硫化胺1分钟;