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钙离子诱导的钙调蛋白动力学及热动力学学分析
目 录
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A b s tr a c t 5
L 绪 ^ 8
1 .1 钙 调 蛋 白概 述 8
1.1.1 钙 调 蛋 白 的氨 基 酸 组 成 及 其 特 征 9
1.1.2 钙 调 蛋 白 的 生 物 功 能 12
辦 翅 16
第 二 章 钙 离 子 诱 导 的 钙 调 蛋 白动 力 学 和 热 动 力 学 研 究 18
2 .1 研 究 背 景 18
2 .2 主 要 研 究 方 法 概 述 19
2 .2.1 圆二 色 谱 (C D ) 技 术 19
2 .2 .2 红 外 (F T -IR ) 技 术 2 0
2 .2 .3 等 温 滴 定 量 热 (IT C ) 技 术 2 1
2 .3 实 验 部 分 2 2
2 .3.1 实 验 材 料 和 药 品 22
2 .3.2 实 验 仪 器 22
2.3 .3 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 的制 备 ^ 3 :丨2 法 ) 2 3
2 .3 .4 质 粒 转 化 2 3
2.3 .5 IP T G 诱 导 C a M 预 表 达 2 4
2.3 .6 IP T G 诱 导 C aM 蛋 白大 量 表 达 2 5
2.3 .7 C a M 蛋 白 的提 纯 2 6
2.3 .8 蛋 白浓 度 的 测 定 2 6
2 .5 实 验 设 计 与 方 法 2 7
2.5.1 圆二色性测 定 C aM -C a2+相互作用 27
2.5 .2 圆 二 色 性 测 定 C a M 在 G u d n H C l 诱 导 的 钙 调 蛋 白去 折 叠 2 7
2.5.3 F T-IR 法测 C aM 在有 无 C a2+存在 下 的二级结构变化 28
2.5.4 F T-IR 法测 C aM 在有无 C a2+存在 下 的氢氘交换 反应 29
2.5.5 等温滴定法研究 C aM 与 C a2+的热动力学反应 29
2 .6 结 果 与 讨 论 30
2.6.1 圆二色性测 定 C aM -C a2+相 互作用 30
2.6 .2 G ud n H C l 诱 导 的 钙 调 蛋 白去 折 叠 30
2.6 .3 水 溶 液 中钙 调 蛋 白 F T -IR 3 1
2 .6 .4 钙 调 蛋 白 H -D 交 换 34
2.6 .5 钙 调 蛋 白 的 等 温 滴 定 3 8
2 .7 本 章 小 结 4 0
4 1
第 三 章 钙 离 子 浓 度 梯 度 对 钙 调 蛋 白构 象 的影 响 4 3
3 .1 弓|t 4 3
3 .2 实验 部 分 44
3.2 .1 实 验 材 料 及 蛋 白提 取 44
1
目
目 录
3 .2 .2 样 品准 备 4 5
3 .3 实 验 结 果 4 5
3 .4 结 果 讨 论 53
参 考 文 献 54
第 四 章 对 韩 调 蛋 白与 蛋 白磷 酸 化 酶 作 用 的初 步 研 究 55 4 .1 钙 调 蛋 白磷 酸 酶 概 述 57
4 .1.1 蛋 白磷 酸 化 酶 的结 构 组 成 5 8
4.1.2 钙调蛋 白磷酸酶 的调节机制 :受 C a2+和 C aM 的调节 59
4 .1.3 C N 的 提 纯一 基 于 N i-N T A 技 术 6 1
4 .1.4 自抑 制 域 (A I ) 的 提 纯 62
4 .2 实 验 结 果 63
詩 讀 64
表 情 5 1 6 6
致 谢 67
2
摘 要
摘 要
摘 要
钙离子 (C alcium ,C a2+) 作为动植物细胞 内重要的第二信使 ,参与细胞 内众 多 的生理反应 。作 为简单 的离子信 号分 子 ,C a2+要将信 号传递下 去 并调节 多种生 化 和 细 胞 反 应 , 其 下 游 感 受 体 (钙 离 子 结 合 蛋 白 ) 是 非 常 重 要 的 。 钙 调 蛋 白 (C alm odulin, C aM ) 是一种最重要 的细胞 内 C a2+信号传感器 。它通过许 多IE 蛋 白涉 及 心 血 管 功 能 的 各 个 方 面 ,包 括 腺 苷 酸 环 化 酶 、众 多 的 蛋 白激 酶 、蛋 白磷 酸 化醇 、一氧化氮合酶及 多种信 号通路 ,特别是 G A P (G TP ase activating protein ) 信 号 通 路 、 电压 门控 通 道 和 S K 钾 通 道 。 钙 调 蛋 白可 以结 合 并 调 节 多 种 靶 蛋 白 ,
从 而 影 响 不 同 细 胞 的 功 能 ,如 炎 症 、代 谢 、凋 亡 、肌 肉 收缩 、细 胞 内运 动 、短 期 和
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