干旱胁迫下发菜固氮酶基因nifh nifd ni化fk的差异表达与基因克隆.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生虢灵 砖杰 时间：彩年上月如 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：芰喃杰 时间：力，／年暨月日 导师签名： 时间：加／∥ 年J月灯日 万方数据 捅要发菜是一种陆生固氮蓝藻，主要分布于干旱、半干旱荒漠草原地区，是当地主要的生物固氮 捅要 发菜是一种陆生固氮蓝藻，主要分布于干旱、半干旱荒漠草原地区，是当地主要的生物固氮 资源和拓荒植物。固氮酶由固氮基因n／f编码，在钼铁固氮酶系统中，n／f霸r基因编码铁蛋白，砌移 基因和n／fx基因编码钼铁蛋白。本研究通过qRT-PCR技术，分析不同干旱胁迫下发菜固氮酶基 因砌曰、n／fO、n／fX在转录水平的表达变化；根据同源物种设计简并性和特异性引物，克隆厕吁、 n／fD、n／iX基因全长，研究其原核表达并进行生物信息学分析。结果表明： (1)发菜固氮酶n／fLr、砌D和n／fX基因随藻体含水量的逐渐降低，基因在转录水平上的表 达量呈逐渐增加； (2)根据简并性引物和特异性引物克隆获得长度为894 bp的删汀基因，GenBank登陆号 为BankItl901364(KU886163)；1443 bp的n／fO基因，GenBank登陆号为BankItl901385 (KU886164)；1536 bp的n／fK基因，GenBank登陆号为Bankltl901391(KU886165)； (3)将厕何、砌D和n／fK基因在大肠杆菌中表达，分别获得一个约36 kD、57 l①、和58∞ 的外源蛋白； (4)生物信息学分析表明：①nifH、nifD和nifK核苷酸序列和氨基酸序列均具有较高的保 守性；②nifH在第240位的丙氨酸亲水性最强，第273位的谷氨酸疏水性最强；nifD在第28位． 的赖氨酸亲水性最强，第359位的蛋氨酸疏水性最强；nifK在第5l位的酪氨酸亲水性最强，第 76位的苯丙氨酸疏水性最强；③nitH蛋白的Ser有4个磷酸化位点、Thr有3个磷酸化位点和 Tys有2个磷酸化位点；nifl9蛋白的Ser有12个磷酸化位点，Yhr有lO个磷酸化位点，Tys有6 个磷酸化位点；nifK蛋白的Ser有15个磷酸化位点，Thr有8个磷酸化位点，Tys有6个磷酸化 位点。④nifH、nifD和nitK蛋白均为膜外蛋白。哟何、n／fO、刀獗基因编码的蛋白，二级结构主 要由Q螺旋、随机卷曲、折叠和转角构成。三级结构预测结果，Ilim、m∞、nifK序列与数据库 中x晶体衍射结构相似度分别为52％、70％和55％。研究结果为进一步研究发菜固氮酶基因的 分子结构和发菜响应干旱胁迫的固氮机理及氮代谢过程奠定了基础。 关键词：发菜，固氮酶，差异表达，基因克隆和表达，生物信息学 万方数据 AbstractNostoc Abstract Nostoc flagelliforme is kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacterium，which grows in desert semi．desert，is primary of local biological nitrogen fixation and pioneer plant．Nitrogenase is encoded bv／f,MoFe Nitrogenase is consist of Ferritin and MoFe protein，and Ferritin is encoded by n／yH,MoFe protein is encoded by n徊and n／yX．The study analyzed the expression changes of nitrogenase gene(n／f／-／、．／fD and聆旧in transcriptional level by qRT-PCR for N．flagelliforme under drought stress．Full fen。gth